猪蹄甲与穿山甲消痈排脓作用分析论文

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 药物穿山甲(Manispentadactylalinnaeus)Manispentadactylalinnaeus)购自河南省药材公司，猪蹄甲购于 郑州肉联厂，经河南中医学院中药品质与资源学博士陈随清教授鉴定为正品。据报道 ［6］，在猪蹄甲所含的 17 种氨基酸中含量位居前三名的为谷氨酸（16.09%）、精氨酸 （8.22%）、亮氨酸（8.15%），此外尚含钠、硫、钙、锌等，以及甾类、胆固醇类成分。 将猪蹄甲和穿山甲同等条件下煎煮，分别用旋转蒸发仪浓缩至相当于含生药 1g/ml，置 4℃冰箱备用。 1.1.2 动物雄性 SD 大鼠 72 只，体重（200±20）g，由河南省实验动物中心提供， 许可证号 SCXK(Manispentadactylalinnaeus)豫)2005－0001。 1.1.3 仪器 B 超，日本 ATL 超声 9-HDIHDI 型；血液流变仪，北京普利生集团；电子天平， 上海电子仪器厂；双目光学显微镜，日本 OlympusBH 系列。 1.2 方法 1.2.1 造模与用药按文献方法［7］将动物术前 12h 禁食，自由饮水，盐酸氯胺酮 （0.2ml/100g）行大鼠腹腔注射麻醉，无菌操作下腹部取正中切口，长约 2cm，开腹后 找出阑尾，将其与邻近回结肠移置腹外，其中 12 只将外置肠管放回腹腔，双层缝合关腹， 设为假手术组；余者均于距阑尾盲端 1cm 处用 1 号丝线环形结扎阑尾，用小圆针细丝线 于回肠末端 1.5cm 处，将回肠和相对应位置的结肠浆肌层缝合 3 针，使已被结扎的阑尾包 埋于缝合的肠段及相应的系膜间，将外置肠管放回腹腔，双层缝合关腹，回笼饲养。造模 第 2 天，除假手术组外，其余大鼠按体重随机分为模型对照组、穿山甲对照组、猪蹄甲高、 中、低剂量组，灌胃（ig）给药。给药剂量见表 1。1 次/d，连续 2 周。给药剂量依据 《中国药典》［8］“穿山甲临床剂量 9g”，按一般成人平均体重 60kg，计算大鼠每千克 体重每天 ig 量相当于生药剂量为：9/60×20（倍）＝3g·kg-HDI1·d-HDI1，猪蹄甲高、中、低剂 量与穿山甲的剂量比，分别为 2∶1，1∶1，0.5∶1。每次 ig 前，从 4℃冰箱取出药液，水浴 微加热至室温，并反复摇匀。 1.2.2B 超检查大鼠肠痈形成情况分别于第 7 天和 14 天，在 B 超下逐只检查造模大鼠 肠痈形成情况，测出脓肿长轴和短轴直径，计算平均直径〔平均直径＝（长轴直径＋短轴 直径）/2〕。（第 7 天模型组随机剖检两只，确定探查的位置）。 1.2.3 血液流变学检查末次给药 40min 后，腹主动脉取血，肝素抗凝。取约 5ml 血 液用作血液流变学检查。 1.2.4 病理组织学检查阑尾脓肿情况分离已形成的阑尾脓肿，剔除周围的脂肪和结缔 组织，按常规病理学方法固定，包埋，切片，将病理切片进行 HE 染色。 1.3 实验数据处理所有结果用±s 表示，数据均用 SPSS11.0 进行单因素方差分析。 2 结果 2.1 用药 7d，14dB 超检查阑尾脓肿直径的变化结果见表 1。结果显示，用药第 7 天 后，在 B 超下观察到各组模型鼠阑尾脓肿包裹完好，边缘清晰，回声明显，假手术组大鼠 阑尾部均无脓肿，提示模型是成功的。14d 后，同样于 B 超下测算的大鼠阑尾脓肿直径的 结果来看，与模型组比较，穿山甲组和猪蹄甲高剂量组脓肿直径均显著缩小，有统计学意 义（P<0.01 或 0.05）。猪蹄甲中、低剂量组与模型组比较无显著性意义（P<0.05）。 提示穿山甲、猪蹄甲对大鼠阑尾脓肿均有消痈肿化脓作用，其中猪蹄甲高剂量与穿山甲作 用相似。表 1 猪蹄甲、穿山甲用药 7d，14d 后大鼠阑尾脓肿直径的变化（略） 2.2 对大鼠阑尾脓肿病理组织学改变的影响代表性病理图见图 1～4。结果表明，模型 组大鼠阑尾脓肿壁可见大量中性粒细胞浸润，组织细胞（如单核巨噬细胞）和纤维细胞增 生不明显。与模型对照组比较，各用药组均使大鼠阑尾脓肿炎症不同程度地减轻；穿山甲 组与猪蹄甲高剂量组形态结构接近，镜下均可见白细胞浸润减轻，组织细胞（如单核巨噬 细胞）和纤维细胞增多，脓液减少，脓腔局部肉芽组织包裹，个别动物发现脓肿壁有血管 反应趋势。猪蹄甲中、低剂量组作用不明显，镜下可见大量嗜中性粒细胞浸润，液化的坏 死组织形成的含有脓液的空腔，组织、纤维增生不明显。 2.3 对阑尾脓肿大鼠血液流变性的影响结果见表 2。结果显示，与假手术组比较，模 型对照组全血比黏度（高、低切变率）和 RBC 压积增高、血沉加快，初步显示该模型可能 具有血淤病机。与模型对照组比较,猪蹄甲高剂量组与穿山甲组全血高、低切黏度、RBC 压积均有所降低，血沉减慢，提示猪蹄甲和穿山甲均可减轻脓肿大鼠黏、浓的血液流变学 病理改变而可能具有活血作用。 表 2 猪蹄甲、穿山甲对阑尾脓肿大鼠血液流变性的影响(Manispentadactylalinnaeus)略) 3 讨论 肠痈，属于内痈范畴，是一种发生于肠间的急性化脓性疾患，中医认为是热毒淤滞于 大肠局部出现的一种痈脓。相当于现代医学的急性化脓性阑尾炎。本模型依据纤维蛋白渗 出促使脓肿形成的机理，结扎大鼠部分阑尾，并缝合相邻肠管使被结扎化脓及坏死阑尾被 网膜及肠管粘连包裹以防止腹膜炎。7d 时溃破或穿孔的阑尾盲端已被肠管及网膜包裹，脓 肿形成，未见腹膜炎形成；14d 时，部分包块局限或缩小，所有造模大鼠活动良好，存活 率为 99%。由于 B 超对脓肿等液性病变诊断定位具有决定性意义［9］，故又分别于造模 第 7，14 天在 B 超下逐只探查造模大鼠阑尾脓肿情况。结果表明，各组模型鼠阑尾脓肿均 定位在腹中线两侧腹内，包裹完好，边缘清晰，回声明显，提示所造模型是成功的。 现代研究表明，“痈”是以大量中性粒细胞浸润为特征的化脓性炎症。本实验前期，已 对猪蹄甲、穿山甲抗炎作用进行了对比实验研究，肯定了猪蹄甲具有与穿山甲相似的抗急、 慢性炎症作用［5］。本实验病理结果表明，模型组大鼠阑尾脓肿壁可见大量中性粒细胞 浸润，组织细胞（如单核巨噬细胞）、纤维细胞和淋巴细胞增生不明显。穿山甲和猪蹄甲 高剂量对减轻脓肿组织白细胞浸润，促使组织细胞、纤维细胞产生及脓腔局部肉芽组织增 生方面作用相似，部分动物脓肿壁肉芽组织增生和血管反应，猪蹄甲中小剂量作用则不明 显，提示穿山甲和猪蹄甲高剂量具有较强的抗炎或促进炎症修复作用。 实验结果初步表明，穿山甲可降低全血高、低切黏度、RBC 压积，使血沉减慢；猪蹄 甲高剂量也显示出较强的作用。临床“痈证”是由于气血为毒邪壅塞不通所致，患者机体往 往伴随“血淤”病机。但是肠痈大鼠毕竟是“病”的动物模型，与血液流变学改变的关系尚无明 确定论。本实验结果显示，模型组肠痈大鼠全血比黏度和 HCT%增高、血沉加快而具有瘀 血倾向。当然是否因大鼠因麻醉手术、饮水过少而造成的血液浓度增加，尚待进一步实验 探讨。 综上所述，初步认为猪蹄甲具有消痈排脓作用，在同等剂量下，猪蹄甲的作用强度低 于穿山甲，但增大剂量等效。 1 仪器及试剂 1.1 仪器 LC-HDI10ATvp 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），RE-HDI52C 型旋转蒸发仪（上海青浦 沪西仪器厂），FQC-HDI100 超声波清洗机（无锡福尼达电子公司频率为 40RHz），SC202-HDI1 型电热恒温干燥箱（通州市沪通制药机械设备厂），FA1004 型十 万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五 厂）。 1.2 试样 夜宁胶囊（江苏康缘药业股份有限公司生产，批号 040526），大黄素标准品（中国 生物制品研究所，批号 0756-HDI200110 供含量测定用），乙醇（分析纯），氯仿（分析 纯），浓盐酸，蒸馏水，甲醇（色谱纯）0.1%磷酸，重蒸蒸馏水（高纯度蒸馏水）。 根据《药品注册管理办法》以及中药新药研究的技术要求，按夜宁胶囊质量标准（草 案）及《中国药典》的相关要求对本品进行稳定性考察。 2 方法 2.1 考察项目 性状、鉴别、崩解时限、含量测定、微生物限度检查。 2.2 考察方法 分别取模拟市售包装条件下的夜宁胶囊 3 批样品，室温条件下保存，于放置 0，1，2，3，6，12，18，24 个月时取样，测定各项指标，检查结果见表 1～2。 3 结果［1～4］ 3.1 性状 本品为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色粉末或颗粒；气微，味甜、微苦。结果见表 1。 3.2 鉴别 应鉴别出合欢皮、灵芝、大黄素、甘草次酸。结果见表 1。 3.3 崩解时限参照《中国药典》2005 年版一部附录ⅫⅫ A。检查，崩解时限应在 30min 内。结果见表 1。表 1 夜宁胶囊 24 个月稳定性中性状、鉴别、崩解时限（略） 3.4 微生物限度检查参照《中国药典》2005 年版Ⅰ部附录Ⅻ部附录ⅫⅫ C 微生物限度检查，细 菌数≤1000 个/g；霉菌≤100 个/g；活螨不得检出；大肠杆菌不得检出。结果见表 2。 3.5 含量测定［5］照高效液相色谱法《中国药典》2005 年版Ⅰ部附录Ⅻ部附录ⅫⅥ D 测定。 3.5.1 色谱条件与系统适用性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-HDI0.1%磷 酸溶液（82∶18）为流动相；检测波长为 254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于为 2000。 3.5.2 对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品适量，加甲醇制成每毫升含 0.02mg 的溶液，即得。 3.5.3 供试品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，混匀，取 1g，精密称定，加 无水乙醇 50ml 回流提取 2 次，1h/次，过滤、合并滤液，回收乙醇，残渣用 30%乙醇-HDI盐 酸（10∶1）20ml 使溶解，置水浴中加热水解 1h，立即放冷，取氯仿震荡提取 4 次、 20ml/次，合并氯仿液、置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解，移置 10ml 量瓶中，并稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(Manispentadactylalinnaeus)0.45μm)m)滤过，取续滤液，即得。 3.5.4 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10μm)l，注入液相色谱仪中，测 定，即得。 本品每粒含首乌藤以大黄素（C15H10O5）计，不得少于 0.05mg。结果见表 2。表 2 夜宁胶囊 24 个月稳定性中微生物限度、含量测定结果（略） 4 讨论［1，5］ 通过室温留样考察法对夜宁胶囊（批号为 040526）进行留样观察并对其进行质量检 查。检查结果表明夜宁胶囊在按市售包装及贮藏条件下，24 个月质量较稳定，可以充分验 证夜宁胶囊的质量标准具有可测性。 1 器材 1.1 动物 KM 小鼠，SPF 级，雌雄各半，体重(Manispentadactylalinnaeus)20±2)g，合格证号：SCXK （甘）2004-HDI0006-HDI0000025；Wistar 大鼠 80 只，SPF 级，雌雄各半，体重 (Manispentadactylalinnaeus)90±10)g，合格证号：SCXK（甘）2004-HDI0006-HDI0000025，由甘肃中医学院实验动物 中心提供。 1.2 药物活血定眩丸（由甘肃中医学院附属医院提供，批号 070501）因丸剂中含有 一定量的辅料，动物实验配制供试样品浓度达不到实验要求的剂量，故采用与丸剂相同工 艺方法制得该药的浸膏（1g 浸膏相当于 2.242g 生药），实验前用蒸馏水配制成实验所需 浓度用于急性和长期毒性实验。 1.3 仪器 CD-HDI1200 型血细胞分析仪（美国，雅培）；ALCYON300 型全自动生化分析仪（美 国，雅培）；电子显微镜 BX60-HDI32FB3-HDIF01 型（日本，OLYMPUS）；切片机 RM2135 型（德国，徕卡）；全自动组织包埋机 TEC-HDIV.CM-HDIJZ 型(Manispentadactylalinnaeus)日本，樱花)；自动组织脱水剂 VIP-HDIJJZ-HDIJZ 型（日本，樱花）。 2 方法与结果［2～4］ 2.1 小鼠急性毒性实验 2.1.1 方法 经对小鼠预试验，结果显示不能测出活血定眩丸剂对小鼠的 LD50，故进行对动物的 最大给药量测定。取 KM 小鼠 40 只，雌雄各半，按体重随机分为两组，分别为给药组和 空白对照组，每组 20 只。于禁食 12h 后（不禁水），给药组以最大给药浓度（1.86g 生 药/ml），0.4ml/10g 体重的给药体积，对照组以等体积的生理盐水，灌胃 2 次/d，间隔 6h，给药后观察 14d，记录Ⅻ动物的死亡及毒副反应症状。实验结束时，将全部动物处死， 解剖，肉眼观察各主要脏器组织病变情况。计算小鼠口服活血定眩丸的最大给药量。 2.1.2 结果 1 日内灌服活血定眩丸 148.8g 生药/kg 体重后，动物活动、进食进水、毛发未见任何 异常。观察 14d 动物无死亡。肉眼尸检未见主要脏器组织明显异常。由此可见，活血定眩 丸小鼠口服最大给药量>148.8g 生药/kg 体重。此剂量相当于临床成人（按 60kg 计）每 日口服剂量 0.2242g 生药/kg 体重的 663 倍。体重变化情况见表 1。表 1 活血定眩丸对急 性毒性实验小鼠体重的影响(Manispentadactylalinnaeus)略) 结果显示，给药组与对照组小鼠的体重变化无显著性差异。 2.2 大鼠长期毒性实脸 2.2.1 方法取 Wistar 大鼠 80 只，按体重随机分为 4 组，雌雄各半，每组 20 只，分 别为活血定眩丸高、中、低剂量组和空白对照组，给药量分别为每日 22.42，11.21，2.242g 生药/kg（分别相当于临床日用药剂量的 100 倍，50 倍，10 倍），给药体积为 1.5ml/100g 体重，各剂量组用等体积不等浓度给药，空白对照组给予 等体积生理盐水溶液 1 次/d，每周给药 7d，连续灌服 6 周。给药前及给药期间每周称体重 1 次，并按平均体重调整给药剂量，实验期间每天观察大鼠一般状态、体征、摄食量、饮 水及粪便状况。发现有中毒反应的动物应取出单笼饲养，重点观察。发现死亡或濒死动物 应及时尸检。于末次给药结束后 24h，每组取一半的大鼠从腹主动脉取血，检查血液学和 血液生化学指标，取血后，立即剖取脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、子 宫等脏器称重，根据体重计算器官重量系数，并对心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠、 大肠、垂体、脊髓、骨髓、淋巴结、膀胱、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胸腺、肾上腺等组 织做病理学检查。 2.2.2 结果 用药组及对照组大鼠在 8 周实验期间均未见异常症状，动物的活动、体重、摄食量、 大便和毛发光泽程度等未见异常。80 只大鼠无一死亡。 活血定眩丸剂对大鼠体重增长的影响：在活血定眩丸连续给药及停药恢复期间，各组 大鼠体重变化一致，无明显异常。结果见表 2。表 2 活血定眩丸剂对实验大鼠体重的影响 (Manispentadactylalinnaeus)略) 结果显示，给药 6 周及停药 2 周后，活血定眩丸各给药组大鼠体重变化与对照组相似， 未见明显的体重改变。 活血定眩丸剂对大鼠血液学的影响：活血定眩丸剂连续给药 42d 时各剂量组大鼠外周 血象检查均在正常范围。结果见表 3。表 3 活血定眩丸剂对实验大鼠血液学的影响(Manispentadactylalinnaeus)略) 结果显示，给药 6 周及停药 2 周后，活血定眩丸各给药组大鼠各项血液学指标与对照 组相似，未见明显改变。