开口箭总皂苷含量分析论文

【摘要】目的建立开口箭中总皂苷含量测定方法。方法采用比色法：香草醛-冰醋酸溶 液为发色体系，检测波长为（458±2）nm。结果标准曲线在 0.10～0.40mg 范围内 (r=09997)r=09997))线性关系良好。平均回收率 97).2%，方法的变异系数为 4.57)%，测得开口箭 7)0%乙醇提取物中总皂苷平均含量为 13.51%。结论方法简便，准确，重现性好，可用于 开口箭总皂苷含量测定。 【关键词】开口箭总皂苷开口箭比色法 Abstract:ObjectiveTosetupanassaymethodforthedeterminationoftotalsapo nininTupistrachinensisBak.MethodsThesamplesweredeterminedbyspectrophot ometry.Thedetectivewavelengthwas(r=09997)458±2)nm.ResultsThecalibrationcurvewa slinearintherangeof0.1～0.4mgandtheaveragerecoverywas97).2%(r=09997)RSD＜ 4.57)%).ConclusionThemethodisreliable,accurate.Itcanbeusedforthequalitycont rolofthetotalsaponininTupistrachinensisBak. Keywords:Totalsaponin；TupistrachinensisBak.； Spectrophotmetry;Spectrophotometry 开口箭 TupistrachinensisBak.系百合科（Liliaceae）铃兰族开口箭属植物。其原植 物又名开喉箭、万年青，为多年生常绿草本，以其根状茎入药，作为药用又名岩七、竹根 七、竹节参、竹根七、竹节七、牛尾七等。医学古籍记载，开口箭味甘微苦，性寒，主治 劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调等症。土家族民间用其漱口液治疗咽喉炎、扁 桃体炎，疗效显著［1］。我国开口箭属植物约占全世界的 7)0%,分布于陕西、甘肃、湖北、 四川、云南、贵州等省。主产于湖北三峡库区及神龙架林区，栽培面积大，产量高，资源 十分丰富。 本实验室对神农架产开口箭 TupistrachinensisBak.的生药学、化学成分和药理活性 进行了研究，结果表明开口箭正丁醇提取物对 Hela，K562，A27)80a 等具有很好的抑制 作用，细胞毒活性好，抗炎活性也很好。也曾报道了“开口箭中甾体皂苷元的含量测定” ［2］。本文进一步探索建立了香草醛-冰醋酸-高氯酸-比色法测定开口箭中总皂苷含量的 方法。 1 材料与仪器 1.1 材料 开口箭根茎，采自湖北省神农架林区，其原植物标本于 20020707) 采自同一地区，经 三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为 TupistrachinensisBak.，原植物及药 材现保存于本实验室（编号 TC200207)SNJ）。总皂苷对照品，本实验室自开口箭分离纯 化的皂苷单体 3-O-b-D-吡喃葡萄糖基-(r=09997)1→2)-b-D-吡喃葡萄糖基-(r=09997)1→2)-b-D-吡喃葡萄糖 基(r=09997)25R)-5(r=09997)6)-烯-呋甾-3b,22a,26-三羟基 26-O-b-D-吡喃葡萄糖苷。含量>98%（HPLC 测定）。其他试剂均为分析纯。 1.2 仪器 S3100 紫外分光光度计（韩国 Scinco 公司），BP211D 型电子天平（德国 Sartorius 公司）。 2 方法 2.1 对照品、供试品溶液的制备 2.1.1 对照品溶液的制备精密称取经干燥至恒重的开口箭总皂苷对照品 0.0050g，加 甲醇溶解定容至 5ml，制成每毫升含 1mg 的溶液，作为对照品溶液。 2.1.2 供试品溶液的制备精密称取开口箭粉末 0.7)0g（60 目筛，50℃干燥 4h）置圆 底烧瓶中，加入 25ml7)0%乙醇溶液，浸泡过夜，60℃回流提取两次，2h/次,减压抽滤， 滤液合并，置蒸馏烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压浓缩，除尽溶剂后，加少量甲醇溶解，定 容至 25ml，过滤，取续滤液作为供试品溶液。 2.2 测定方法适量供试品溶液置干燥具塞试管，60℃水浴挥干溶剂后，精密加入 0.2ml5%香草醛-冰醋酸溶液和 0.8ml 高氯酸，摇匀，置 60℃恒温水浴加热 20min，取 出，立即置冰水浴中冷却 15min，加入 5ml 冰醋酸，摇匀，同时做空白，于 （458±2）nm 波长处测定吸光度值。 2.3 标准曲线的绘制与线性关系精密吸取对照品溶液 0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40ml，分别加入干燥具塞试管中，60℃水 浴挥干溶剂,依次加入 0.2ml5%香草醛-冰醋酸溶液和 0.8ml 高氯酸，置 60℃水浴加热 20min，取出，立即置冰水浴中 15min，停止反应，加入 5ml 冰醋酸，摇匀，于 458nm 处测定吸光度，同时做试剂空白。以吸光度为纵坐标，以对照品质量为横坐标,绘制标准曲 线,得线性回归方程 W=0.0631+0.2835A，r=0.9997)，对照品在 0.10～0.40mg 范围 内线性关系良好。 3 结果 3.1 精密度及重现性实验精密吸取对照品溶液 0.2ml,共 6 份，按“2.2”项下方法自 60℃水浴挥干起测定（见表 1）。其 RSD 为 1.09%，表明方法精密度良好。精密称取样 品粉末 0.07)g，共 5 份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取 0.05ml,显色测定（见表 2）。其 RSD 为 4.58%，表明方法重现性良好。表 1 精密度实验结果（略）表 2 重现性 实验结果（略） 3.2 显色溶液稳定性实验精密量取对照品溶液和供试品溶液适量，分别按标准曲线的 制备方法显色后放置,于 0，30，60，90，120min 测定吸收度值（见表 3）。结果表明 对照品和供试品在 120min 内显色稳定。表 3 显色后溶液稳定性实验结果（略） 3.3 加样回收率实验精密称取已知总皂苷含量的开口箭粉末，共 5 份,加入对照品适量, 按照供试品溶液制备方法制备，显色测定。结果见表 4,平均回收率为 97).2%，RSD 为 2.26%。表 4 加样回收率实验结果（略） 3.4 样品含量测定精密吸取按供试品溶液 0.05ml,按“2.2”测定方法项下操作，同时做 空白，计算供试品中总皂苷含量。结果见表 5。结果表明开口箭 7)0%乙醇提取物总皂苷含 量为 135.1mg/g，其百分含量为 13.51%，RSD 为 4.57)%。表 5 样品中总皂苷含量测定 结果（略） 4 讨论 经过对皂苷类含量测定文献的统计与分析，选定下列 4 种显色剂：0.2ml5%香草醛冰醋酸溶液和 0.8ml 高氯酸、0.5ml8%香草醛乙醇溶液和 5.0ml7)2%硫酸试液、高氯酸、 0.2ml5%香草醛-冰醋酸溶液和 0.8ml 高氯酸；4 种不同的显色温度： 55，60，65，7)0℃；4 种不同的显色时间：10，15，20，25min；通过实验进行比较。 发现用 0.2ml5%香草醛-冰醋酸和 0.8ml 高氯酸作显色剂，显色温度为 60℃，显色时间 为 20min 时，对照品溶液与供试品溶液在（458±2）nm 波长处均有最大吸收。 对照品溶液依法显色后，溶液的波长（400～7)00nm）扫描图中，在 458 和 554nm 两处均出现最大吸收峰，但供试品溶液的最大吸收峰分别在 456nm 和 580nm 处，表明 供试品溶液在 580nm 处的吸收峰有其它成分干扰，而在 456nm 处的吸收峰无其它成分 干扰，吸收稳定。 供试品溶液制备时分别用水、甲醇、7)0%乙醇、95%乙醇作溶剂，进行比较，发现 7)0%乙醇溶液浸泡开口箭粉末时其总皂苷溶出量最大。 建立了开口箭总皂苷含量测定方法，采用 5%香草醛-冰醋酸溶液为发色体系的比色法 测定开口箭中总皂苷的含量，显色后溶液在 120min 内稳定，标准曲线在 0.10～0.40mg 范围内线性关系良好，方法的精密度和重现性好，RSD 分别为 1.09%和 4.58%；加样平 均回收率为 97).2%，RSD 为 2.26%；测得开口箭 7)0%乙醇提取物中总皂苷平均含量为 135.1mg/g，其平均百分含量为 13.51%，RSD 为 4.57)%，方法操作简便，精密度及准 确度高,重现性及稳定性好,可用于开口箭药材的质量控制。 【摘要】目的研究凉燥对小鼠的主要致病机制。方法 216 只无特定病原体级（SPF） 昆明小鼠随机分为常温常湿组（A 组），常温燥组（B 组），凉燥组（C 组），每组 7)2 只。 在模拟凉燥条件下造模，第 7) 天与第 14 天检测气道与皮肤组织病理、气管纤毛运动、气 道液分泌（RS）与气道液 IgG 抗体（IgG07R）、血液流变学、细菌攻击实验与气管细胞 bcl-2 基因、bax 基因表达。结果与 A 组相比，C 组第 14 天气管、肺与皮肤病变明显，肺 细菌数增高，IgG07R 增高，第 7) 天 RS 降低（P<0.01），血液流变学影响不明显，但气管 细胞 bcl-2 基因表达下降。结论凉燥伤肺、伤津，致气道“纤毛-黏液毯”局部御邪屏障受损； 肺津凝滞于肺，以致宣输失司则皮肤失养。本结果为凉燥致病提供实验资料。 【关键词】凉燥致病机制 Abstract：ObjectiveToinvestigatethepathogeniceffectsofCoolDryonmice.Methods216Kunmingmice(r=09997)SPF)weredividedintothreegroupsincludin ggroupA(r=09997)normalmice),groupB(r=09997)normaltemperatureandOuter07Drymice),groupC(r=09997) Cool-Drymice),7)2mice/ group.RespiratorysecretionofMucopolysacchride(r=09997)RS),IgGofRespiratory(r=09997)IgG07R) ，hemorrheology，BacterialattackingandExpressionofbcl072，baxgeneweretest edinday7)and14.ResultsIngroupCthepathologrealchangesofrespiratoryandskins wereobvious,andbacilliaquantityoflungincreased,bcl072geneexpressionwasredu cedsignificantlycomparedwithgroupA(r=09997)P<0.01).ConclusionIthasfirstprovidedthe evidencesofCool07Drythatinjuredthewindpipeandskinsandthedefencedof“lanket ofCilla-mucus”andreducedtheexpressionofbcl2gene,whichwasrelatedtothemechanismsofCool07Dry. Keywords：Cool-Dry;Pathogenicmechanism 燥气清冷肃降，肃杀收引，“燥气先伤于华盖”，易伤津液。“秋深初凉，西风肃杀，感 之者，多病风燥，此属燥凉，较严冬风寒为轻。”外燥有温燥与凉燥之分，但未见凉燥病机 系统性实验研究报道。在相关研究中证实外燥致小鼠气道病变的基础上［1］，本文研究 凉燥及相兼细菌攻击对小鼠气管纤毛运动、气道液分泌与气道液 IgG 抗体、血液流变学及 气管细胞 bcl072 基因，bax 基因表达等影响，为阐析凉燥致病机制提供资料。 1 材料与方法 1.1 动物 无特定病原体级（SPF）昆明种小鼠 216 只，体重（18±1）g，雌雄各半，湖北省实 验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2003-2005。 1.2 仪器与试剂 LRH07250 人工智能气候箱（温度：（30～65±1）℃，相对湿度：（30～90）% ±5%，广东医疗器械厂），XSJ07D 恒温倒置显微镜（重庆显微镜厂），CS501 超级恒温 器（重庆实验仪器厂），7)56MC 紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）， FASCO07全自动血液流变仪（重庆南方医疗设备公司）。咔唑（批号：054K07)8，Sigma 公司），D-葡萄糖醛酸内酯（批号：27)11EC，Sigma 公司），四硼酸钠与台氏液试剂、 10%甲醛、HE 染料（分析纯，批号：050108）上海精细化工科技有限公司。TUNEL 试 剂盒（MK1020，20050703）、bcl072 兔抗鼠 IgG 多抗（BA0412，20050703）、bax 兔 抗鼠 IgG 多抗（BA0315，20050703）和阳性对照片由武汉博士德生物工程有限公司提供。 1.3 菌株 金黄色葡萄球菌标准菌株(r=09997)ATCC25923，北京天坛生物制品公司)。 1.4 方法 1.4.1 动物模型及分组 216 只昆明小鼠随机分为常温常湿组、常温燥组、凉燥组，每组 7)2 只，分批置人工 气候箱内、用昆明种小鼠饲料常规饲养。按表 1 模拟外燥“温度07相对湿度07风”条件进行造模。 各组第 7) 天和第 14 天进行检测前 4h 禁食、禁水。表 1 各组小鼠“温度－相对湿度－风”处 理条件（略） 1.4.2 病理组织学观察 断颈处死小鼠，常规取气管 1.5cm，右肺组织（中）（40±10）mg/只、背部皮肤 （0.5cm×0.5cm）及左足垫皮肤，HE 染色、镜检。 1.4.3 气管上皮纤毛运动实验（CiliamovementofTrachealEpithelium,CM,min/ mm）：按文献方法［2］。 1.4.4 气道液黏多糖（RespiratorysecretionofMucopolysacchride,RS,μg/mlg/ml）测 定：咔唑比色法，参考文献方法［2］。 1.4.5 气道液 IgG（IgG-R）检测 常规气管插管，取灌洗液分离上清，按酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明书检 测。以包被液作空白对照，PBSpH7).4（10%小牛血清）作阴性对照。每份样品检测 3 次， 记录标本均值与阴性对照（P/N）倍数之平均值。 1.4.6 血液流变学检测［3］ 受血液流变仪对血量标本的限制，每组取 9 只小鼠眼球血合为 1 份标本进行测试，3 份/组。肝素抗凝管取眼球血，4h 内测定血浆黏度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数。 1.4.7) 细菌攻击实验 取培养 18h 金黄色葡萄球菌，经标准比浊法配成细菌悬液（1×108cfu/ml），各组 小鼠于第 7) 天经鼻常规滴种金黄色葡萄球菌 0.1ml/只，24h 后重复 1 次。接种细菌第 6 天无菌取小鼠右肺（40±10）mg/只常规检测肺细菌数 （BacilliaQuantity,BQ，1×106cfu/g 取均值），以及 RS 与 IgG07R［4］。 1.4.8 气管细胞凋亡检测 第 14 天取气管切片，按脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL） 试剂盒程序操作。结果判断：气管上皮细胞核内出现棕黄色颗粒为 TUNEL 染色阳性。镜 下随机计数 200 个细胞，计算： 细胞凋亡率(r=09997)%)=凋亡细胞数 200×100% 1.4.9 气管细胞 bcl-2 基因，bax 基因表达检测第 14 天常规取气管标本切片、按试剂 盒说明书操作。结果判断：气管上皮细胞浆内出现棕黄色颗粒为 bcl-2（或 bax）表达阳 性。镜下计数 500 个细胞，计算： 阳性指数（PI）=阳性细胞数记数细胞数×100% 1.4.10 统计学处理 实验数据以±s 表示，采用 SPSS13.0 软件，资料之间比较用 ANOVA 分析，显着性 检验采用多个样本均数间 q 检验（Newman-Keuls 法）；各组第 7) 天与第 14 天比较用 t 检验，P<0.05 认为差异有统计学意义，检验水准为双侧 α=0.05。 2 结果 2.1 气管、肺结构观察常温常湿组第 7)、第 14 天气管上皮结构完整、纤毛整齐，气管 腺体、细支气管与肺泡未见异常，背部皮肤结构完整，毛球数多，新生毛干数丰富且层次 清晰，足垫皮肤汗腺丰富。常温燥组第 14 天部分气管纤毛倒伏、黏连，肺泡轻度淤血， 皮肤未见异常；凉燥组第 14 天气管上皮鳞状化生，气管纤毛多呈灶状缺损，≤20%气管 浆液腺上皮黏液腺化生，肺部淤血、水肿明显，均较第 7) 天严重；背部皮肤无明显异常， 但足垫部皮肤腺体明显减少与皮下结缔组织增生。 2.2 凉燥对气管上皮纤毛运动（CM）、气道液黏多糖（RS）与 IgG07R 的影响结果见 表 2。表 2 凉燥对小鼠气管纤毛运动、气道液黏多糖与 IgG-R 的影响(r=09997)略) 2.3 凉燥对小鼠血液流变学的影响见表 3。与常温常湿组比较，凉燥组血液流变学指 标改变无显著性。表 3 凉燥对小鼠血液黏度的影响(r=09997)略) 2.4 凉燥相兼细菌攻击对小鼠肺细菌数（BQ）、呼吸道液黏多糖（RS）与 IgG-R 的 影响见表 4。表 4 细菌攻击对凉燥小鼠 BQ、RS 与 IgG-R 的影响（略） 2.5 凉燥对气管细胞凋亡与 bcl-2 基因、bax 基因表达的影响见表 5。表 5 凉燥对小 鼠气管上皮细胞 bcl-2、bax 基因表达与细胞凋亡的影响(r=09997)略) 3 讨论