真菌种群分布及抗菌性研究论文

【摘要】目的分析小连翘(HyperioumssampsoniiHance)HyperioumssampsoniiHance)内生真菌的分布特征和抗 菌活性。方法采用内生菌分离法分离菌株,双培养法对峙试验测定其抗菌性。结果从小连翘 的根、茎、叶等不同的器官中分离得到 81 株内生真菌,经形态学分类鉴定分属于 4 个目,5 个科,26 个属,其中头孢霉属(HyperioumssampsoniiHance)Cephalosporiumsp.))和丝核菌属(HyperioumssampsoniiHance)Rhizoctoniasp.))为优势 菌群。不同部位内生真菌的类型、数量和分布存在差异,根部有 31 株,分属于 12 属;茎部有 12 株,分属于 10 属;叶部有 38 株,分属于 13 属。通过平板对峙实验发现,从小连翘所分离 的内生真菌中 54.)32%对某些植物病原真菌有拮抗活性。结论小连翘内生真菌及其代谢产 物中具有潜在活性物质,值得深入研究。 【关键词】内生真菌;小连翘;拮抗活性 StudiesoncommunitiesofendophyticfungifromHyperioumssampsoniiHance andtheirantipathogenicactivitiesinvitro Abstract:Theendophyticfungiwereisolatedandidentifiedmorphologicallyfro mtheroots,stemsandleavesofHyperioumsSampsoniiHance.)Eightyonestrainsofonestrainsof endophyticfungiwereisolatedandbelongedto26genera,5familiesand4orders.)Ce phalosporiumsp.)andRhizoctoniasp.)werethedominantgenera.)Among81strains,3 1strainsof12generawereisolatedinroots,12strainsof10generainstems,and38str ainsof13generainleaves.)Theresultsshowedthatthequantity,population,anddistri butionoftheendophyticfungivariedindifferentpositionsofHyperioumsSampsonii Hance.)Inthedualculturetests,53.)48%ofalltheisolatedEndophyticfungishowedan tagonistictosomeplantpathogens.)Theseendophyticfungiinsidetheplantshaveint imatecorrelationwiththeirhosts.)Theseendophyticfungiandtheirmetabolitesmigh tplayanimportantroleintheplantsagainstthepathogens.) Keywords:endophyticfungi;HyperioumsSampsoniiHance;antipathogenicact ivities 小连翘(HyperioumssampsoniiHance)HyperioumssampsoniiHance),别名小翘、七层兰、瑞香草、元宝草等,为 多年生双子叶植物药藤黄科植物,味苦、性辛、平[1]。全草含鞣质,有光致敏作用,动物食后 可产生皮炎;含小连翘碱(HyperioumssampsoniiHance)hypecorine)和小连翘次碱(HyperioumssampsoniiHance)hypecorinine);花含金丝桃素 (HyperioumssampsoniiHance)hepericin)[2],有活血、止痛、调经、止血、消肿之效;小连翘或其提取物作为有效药物成 分用于制备治疗睡眠障碍、老年痴呆、记忆力减退等病症的药物[3];同属植物贯叶连翘,在 西方国家称圣约翰草,用于治疗忧郁症等疾病已有几百年的历史[4]。近年来的研究表明小 连翘也具有抗忧郁作用[5]。文献报道,小连翘中含有聚(HyperioumssampsoniiHance)异)戊二烯二苯甲酮类衍生物、萘骈 双蒽酮类和黄酮类等多种化学成分,这些成分是小连翘药理作用的主要有效成分,但是要提 取和分离这些药物成分还有很多困难[6]。近来研究表明,某些药用植物中个别内生真菌能 够产生与宿主相同或者相似药理活性的成分[7],由此对药用植物内生真菌的研究引起人们 的广泛关注。如果在小连翘内生真菌中能够发现类似的活性物质,无疑找到了一种可替代小 连翘植物的新型生物资源。但是至今未见从小连翘中分离及其内生真菌的种群多样性的研 究报道。本文对小连翘内生真菌进行了分离和分类鉴定,并对其种群多样性及内生真菌拮抗 病原菌的活性的研究报道如下。 1 材料与方法 1.)1 材料分离所用材料为小连翘的根、茎、叶,采自中国科学院华南植物园(HyperioumssampsoniiHance)广州)。采 集其健康的组织,无其它病虫害,根、茎与叶分开采集,放于密封袋中,于 4℃存放,尽快进行 内生真菌的分离。碘伏:威的牌消毒液,主要成份是聚乙烯吡咯烷酮碘(HyperioumssampsoniiHance)即碘伏),液体剂型,有 效碘含量为 0.)5%,是一种新型的 PVP-I 消毒剂,深圳市新华鹏消毒剂有限公司生产。NS 液:0.)9%NaCl;ST 液:0.)9%NaCl,0.)5%吐温 80;中和剂:0.)9%NaCl,0.)5%吐温 80,0.)5%硫 代硫酸钠。 PDA 培养基:马铃薯 200g,葡萄糖 20g,琼脂 20g,水 1000mL,pH7.)0。在进行内生真 菌的分离时,向培养基中分别加入青霉素、链霉素至 50μg/mLg/mL。 1.)2 供试菌株纹枯病菌(HyperioumssampsoniiHance)Rhizoctoniasolani)、白叶枯病菌 (HyperioumssampsoniiHance)Xanthomonasoryzaepv.)Oryzae)、恶苗病菌(HyperioumssampsoniiHance)Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病 菌(HyperioumssampsoniiHance)Fusariumoxysporiumf.)sp.)vasinfectum)由中山大学生命科学院微生物和生化教研 室提供。 1.)2 方法 1.)2.)1 植物材料的处理样品采于 2005 年 10 月。样品用自来水冲洗干净后,取不同部 位的茎或叶若干,剪成小块,分别放于三角瓶中;加入碘伏消毒液(HyperioumssampsoniiHance)使用时有效碘浓度为 2500mg·L-1),不断摇动,消毒 5min。吸去消毒液,加入无菌 ST 液,荡洗 1min,吸去液体。 重复一次。经表面消毒后的样品可用于接种。 1.)2.)2 内生真菌的分离、纯化茎内内生真菌的接种:用无菌刀片削去茎的皮及已裸露的 切面,然后切取约 2~5mm 的切片若干,先置于无菌平皿中。再将样品置于无菌研钵中,加入 石英砂和 1mLST 液,将样品研成浆。取适量的浆液涂布于 PDA 平板。为了保证样品有足 够的代表性,每个样品要用若干段茎,一段茎仅涂一个平板,共需涂 5~10 个平板。根叶样品 的处理基本同茎。将涂布好的平板置于 28℃培养,每隔 12h 观察真菌菌落形成情况。培养 基中一出现菌落,立即将此处的小块琼脂挖出,将平板再放回 28℃培养 10d,计数各平板上 的菌落总数。挖出的含真菌的小块 PDA 立即置于含 PDA 的小试管中培养,待真菌长出后,再 在 PDA 平板上采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。待菌落出现后,根据菌落形态、颜色的差异 以及长出时间的不同,分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养。 在培养数日后,观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况,并做相应的记录,包括影象记录,对 菌株编号后,转至 PDA 斜面培养基上,于 28℃培养箱中培养 5~7d,然后放入 4℃冰箱保存。 1.)2.)3 表面消毒效果检测表面消毒后的样品于 5mL 无菌水中振荡 1min,取 0.)3mL 悬 液涂布于 PDA 平板上,在 28℃培养,记录是否有真菌生长。另外,采用存活试验观察表面消 毒效果,即将分离的内生真菌菌苔经过各自表面消毒程序处理后,再接种到 PDA 平板 28℃ 培养后,观察是否生长。 1.)2.)4 菌种鉴定从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成玻片,置于光学 显微镜下观察菌丝形态、孢子梗形态、孢子形态以及孢子与营养体之间的着生关系,对照有 关资料确定真菌的分类学地位[8]。 1.)2.)5 对峙试验将 4 种植物病原菌(HyperioumssampsoniiHance)纹枯病菌、稻瘟病菌、白叶枯病菌、恶苗病菌)接 种于平板中央,内生真菌接种于平板边缘,28℃培养,观察病原菌菌落周围的变化。 2 结果 2.)1 表面消毒效果表面消毒后的样品振荡液 0.)3mL 分别涂布于 PDA 平板培养基 上,28℃培养 2 周后无菌落长出,同时 10 株分离的代表性真菌菌苔分别经过消毒过程处理 后接种到 PDA 平板上,28℃培养 2 周后,没有观察到菌落生长。表明经过样品消毒处理过程, 样品表面附生菌的影响已消除,分离的菌株来自于样品内部,与植物组织结合紧密。 2.)2 小连翘内生真菌种群组成从植物小连翘分离获得内生真菌共 81 株。经显微形态观 察鉴定为 4 个目,5 个科,26 个属(HyperioumssampsoniiHance)见表 1)。从表 1 可以看出,植物小连翘内生真菌中,从目的 分类水平上以丛梗孢目(HyperioumssampsoniiHance)Moniliales)和无孢菌群(HyperioumssampsoniiHance)Myceliasterilia)为优势菌群,分别为 50 株和 23 株占总菌株数的 61.)7%和 28.)4%;在属的分类水平上以头孢霉属 (HyperioumssampsoniiHance)Cephalosporiumsp.))和丝核菌属(HyperioumssampsoniiHance)Rhizoctoniasp.))为优势菌群,分别为 20 株和 16 株,占 总菌数的 24.)7%和 19.)7%。 2.)3 植物小连翘不同部位内生真菌的分布对小连翘根茎叶内生真菌的种类,数目和分布 部位进行统计分析,结果见表 2。 表 1 小连翘植物内生真菌种群组成(HyperioumssampsoniiHance)略) Tab.)1ThecomposingofendophyticfungiinHyperioumssampsoniiHance 从表 2 中看出,从小连翘植株内分离的 81 株内生真菌的分布各有特点,根部分布有 31 株内生真菌(HyperioumssampsoniiHance)占总数的 38.)2%),隶属于 12 个属(HyperioumssampsoniiHance)占 26 个属的 46.)2%);茎部分布有 12 株内 生真菌(HyperioumssampsoniiHance)占总数的 14.)9%),分属于 10 个属(HyperioumssampsoniiHance)占 26 个属的 38.)5%);从叶部分离出的 38 株内 生真菌(HyperioumssampsoniiHance)占总数的 469%),9%),分属于 13 个属(HyperioumssampsoniiHance)占 26 个属的 50%)。由此可知,小连翘的内生真 菌主要存在于植株的叶和根中,茎部组织中分离到的内生真菌相对较少。从根茎叶中分离到 的内生真菌的种属分布来看,头孢霉属(HyperioumssampsoniiHance)Cephalosporiumsp.))在叶部、根部和茎部都有分 布,说明头孢霉属(HyperioumssampsoniiHance)Cephalosporiumsp.))不仅是叶部的优势种群,而且也是整株小连翘植物 内生真菌的优势种群。丝核菌属(HyperioumssampsoniiHance)Rhizoctoniasp.))仅在根部分布,是根部的优势种群,占根 部所有分离到的内生真菌的 51%。另外,短梗霉属(HyperioumssampsoniiHance)Aureobasidiumsp.))、鞘孢霉属 (HyperioumssampsoniiHance)Chalarasp.))、束丝菌属(HyperioumssampsoniiHance)Ozoniumsp.))也只在根部分布;而串珠孢霉属(HyperioumssampsoniiHance)Moniliasp.))、曲 霉属(HyperioumssampsoniiHance)Aspergillussp.))、粘帚霉属(HyperioumssampsoniiHance)Gliocladiumsp.))、痕格霉属(HyperioumssampsoniiHance)Sirosporiumsp.))、弯孢 霉属(HyperioumssampsoniiHance)Curvulariasp.))、毛壳菌属(HyperioumssampsoniiHance)Chaetoniumsp.))和直毛壳菌属(HyperioumssampsoniiHance)Ascotrichasp.))的内生 真菌只在叶部分布,而叶组织内生真菌的优势种也和根部不同,头孢霉属和痕格霉属内生真 菌是叶部的优势菌群;从茎部分离的内生真菌的优势菌群不明显,其中分离到的木霉属 (HyperioumssampsoniiHance)Trichodermasp.))、黑孢霉属(HyperioumssampsoniiHance)Nigrosporasp.))、芽枝霉属(HyperioumssampsoniiHance)Cladosporiumsp.))内生真菌 只在茎部分布。结果表明,小连翘根茎叶组织的不同部位所分离到的内生真菌的数量不同, 所分离到内生真菌的分布和优势种群也存有差异。 表 2 小连翘植物内生真菌数量与分布(HyperioumssampsoniiHance)略) Tab.)2ThenumberanddistributionofendophyticfungispeciesinHyperioumssa mpsoniiHance 2.)4 内生真菌对植物病原菌的拮抗作用通过平板对峙试验分别对从小连翘中所分离的 81 株菌对植物病原菌纹枯病菌(HyperioumssampsoniiHance)立枯丝核菌)(HyperioumssampsoniiHance)Rhizoctoniasolani)、白叶枯病菌 (HyperioumssampsoniiHance)Xanthomonasoryzaepv.)Oryzae)、恶苗病菌(HyperioumssampsoniiHance)Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病 菌(HyperioumssampsoniiHance)Fusariumoxysporiumf.)sp.)vasinfectum)的抑菌活性进行测定(HyperioumssampsoniiHance)图 1)。结果发现,从小 连翘中分离的 81 株内生真菌中共有 53 株对一种或多种病原菌有拮抗作用(HyperioumssampsoniiHance)占总分离株数 的 52.)48%)。其中对恶苗病菌有抑菌作用的有 23 株,对白叶枯病菌有抑菌作用的 18 株,对 纹枯病菌有抑菌作用的有 12 株,对棉花枯萎病菌有抑菌作用的有 4 株。这表明多数小连翘 内生真菌具有抗植物病原菌的功能,在小连翘中存在着广泛的抗菌生物活性资源。 A.)内生真菌 J-53 拮抗纹枯病菌;B.)内生真菌 f-55 和 f-166 拮抗恶苗病 Dualculturebetweenendophytesandpathogens 3 讨论 从近年来的研究看,植物体中存在内生真菌是普遍的。内生菌系统地分布于植物体根、 茎、叶、花、果实和种子等器官、组织的细胞或细胞间隙。有报道说,内生真菌菌丝在宿主 植物的叶鞘和种子中含量最多,而叶片和根中含量极少[9]。但是也有报道,根和叶内生真菌 含量较多[10]。不同的植物可能具有的内生真菌的种类和数目相差很大。我们从中药植物 小连翘的根、茎、叶共分离出 81 株内生真菌,分属于 4 个目,5 个科,26 个属。头孢霉属 (HyperioumssampsoniiHance)Cephalosporiumsp.))在小连翘根、茎、叶内生真菌的分离过程中都得到,它既是叶内的 优势菌群也是整个植物的优势菌群;丝核菌属(HyperioumssampsoniiHance)Rhizoctoniasp.))分离获得的数量比较多,但 是它仅仅是根内的优势菌群。植物内生真菌生活在活体植物组织中,其生长代谢受多方面因 素制约,不仅受到宿主植物的影响,外界环境因子也是其重要影响因素。外界环境变化直接 影响植物生长代谢,间接影响到植物内生菌生物多样性与生长代谢。从小连翘的根、茎、叶 不同部位分离的内生真菌在数量、种类有很大的差异。小连翘的大部分内生真菌主要存在 于叶和根部,而茎中相对很少,这表明不同的内生菌在植物不同器官和组织中占据不同的生 态位。其原因可能是由于不同部位的微环境如通气状况、生物酶和其他化学成分的不同,从 而适合不同种属的内生真菌类群的侵入和生长。迄今的研究表明,植物内生菌与宿主发生联 系时,对宿主有以下影响:可增强宿主的抗病性、提高植物的生产力[11]、抗逆抗虫[12]、 具有除草剂活性[13]等。内生真菌对宿主的作用机制可能是由于内生菌在植物体内繁殖和 生长,并产生丰富多样具有生物活性的次生代谢产物,从而在一定程度上调节植物的生长和 代谢。通过对峙试验研究小连翘内生真菌对纹枯病菌、白叶枯病菌、恶苗病菌和棉花枯萎 病菌等植物病原菌的拮抗性,结果发现,小连翘内生真菌中多数种类(HyperioumssampsoniiHance)约 52.)48%)能够抑制一 种或者多种病原菌的生长,这表明小连翘内生真菌中存在着广泛的抗菌生物活性资源,这些 内生真菌及其代谢产物在植物对抗病原菌的过程中占有一定的地位。由此可见,药用植物内 存在着广泛的内生真菌,这些内生真菌可能成为生物防治中有潜力的生物因子,在生态农业 和生物农药研制方面具有重要的用途。研究内生真菌的各种次生代谢产物及其作用机制,在 农业和(HyperioumssampsoniiHance)或)医药业中具有重要的应用潜力。研究和开发植物内生真菌,从而为寻找植物病害 的抗菌药用资源提供了一条新的途径。 【摘要】目的观察安贺拉滴眼液应用于兔干眼症治疗的免疫病理学变化,初步探讨安贺 拉滴眼液治疗干眼症的可能机制。方法新西兰白兔 20 只,制作碱烧伤干眼模型,随机分为对 照组和安贺拉组,分别滴生理盐水和安贺拉滴眼液。用药 4 周后应用印迹细胞学和免疫病理 学方法检测结膜杯状细胞密度、MUC5AC 阳性细胞率和炎性细胞浸润密度。结果对照组结 膜炎性细胞浸润密度高于安贺拉组,安贺拉组杯状细胞密度和 MUC5AC 阳性细胞率均大于 对照组(HyperioumssampsoniiHance)P<0.)05)。结论安贺拉滴眼液可以降低兔眼表的炎症反应,促进杯状细胞增殖,在干 眼症治疗方面具有一定的应用前景。 【关键词】安贺拉滴眼液;干眼症;兔;免疫病理学 Abstract:ObjectiveTodiscussthemechanismofketorolactromethmineeyedro psinrabbitsdryeyewithalkaliburnsinconjunctivabyobservingtheimmunopatholo gicprocessafteritwasused.)MethodsTwentyrabbitmodelswereestablishedbyburn ingwithalkaliinconjunctiva,andthendividedintotwogroupsrandomly:theexperim entalgrouptreatedwithketorolactromethmineeyedropsandthecontrolgrouptreat edwithsaline.)Byusingimmunopathologictechniquesandimpressioncytologytest, densityofgobletcell,positiverateofMUC5ACanddensityofinflammatorycellinconj unctivawerestudiedthe4thweekafterdrugused.)ResultThedensityofgobletcell,an dpositiverateofMUC5ACinexperimentalgroupwashigherthanthatofcontrolgroup andlowerinthedensityofinflammatorycell(HyperioumssampsoniiHance)P<0.)05).)ConclusionKetorolactrometh mineeyedropscanreduceocularsurfaceinflammationandincreasethenumberofg obletcellsinrabbits,suggestingitisvaluabletodryeye.) Keywords:ketorolactromethmine;dryeye;rabbit;immunopathology 干眼是指任何原因引起的泪液质或量及动力学的异常,导致泪膜不稳定和(HyperioumssampsoniiHance)或)眼表面的 异常,并伴有眼部不适症状的一类疾病。干眼的主要症状有眼部干燥、异物感、视疲劳、畏 光及视力下降等,轻者影响工作和生活,严重者可导致眼表尤其是角膜组织干燥、融解、穿 孔,严重危害视功能[1]。干眼作为最常见眼表疾病有日趋增多的趋势,其药物治疗方法多种 [2]:泪液替代疗法、黏液溶解药、局部自家血清、抗生素等。随着干眼发病机制的深入研 究,现已认识到由炎症介质介导的炎症反应参与几乎所有类型干眼的病理生理过程。本研究 采用新型药物——安贺拉滴眼液作用兔干眼模型,研究其疗效及可能的作用机制。 1 材料与方法 1.)1 主要仪器与试剂 LeicaMEL53 型眼科手术显微镜(HyperioumssampsoniiHance)瑞士 WILDLEITZ 公 司),YZonestrainsof5CSI 型裂隙灯显微镜(HyperioumssampsoniiHance)苏州医疗仪器厂),Olympusonestrainsof10AK 照相显微镜(HyperioumssampsoniiHance)日本欧林巴 斯光学公司),低温恒冷切片机(HyperioumssampsoniiHance)美国 Leica 公司),安贺拉滴眼液(HyperioumssampsoniiHance)Acular,美国 Allergan 公司 产品),16mm×6mm 的滤纸条,1mol/L 的 NaOH(HyperioumssampsoniiHance)广州化学试剂厂),1%荧光素钠溶液,1% 虎红溶液(HyperioumssampsoniiHance)广西梧州制药股份有限公司),免疫组化试剂盒和 MUC5AC 抗体(HyperioumssampsoniiHance)美国 Sigma 公 司)。 1.)2 动物选择与分组健康成年新西兰白兔 20 只,雌雄各半,体质量 2.)0~2.)5kg。随机分 为实验组和对照组,每组 10 只,右眼为实验眼。购自广东省医学实验动物中心,合格证 号:SCXK(HyperioumssampsoniiHance)粤)2003-0002,粤监证字 2006A001。 1.)3 实验方法 50mg/2mL 盐酸氯丙嗪+100mg/2mL 氯氨酮肌肉注射麻醉兔,切除右 眼第三眼睑,并用 2 张 16mm×6mm 的滤纸条蘸 1mol/L 的 NaOH 溶液置于距兔角膜缘上 方 2mm 的结膜上,90s 后立即用 100mL 生理盐水反复冲洗结膜囊。术后对照组局部应用 生理盐水滴眼,每日 3 次;实验眼局部应用安贺拉滴眼液,每日 3 次。用药 4 周后行结膜印迹 细胞学检查,并取病变区结膜行组织病理学检查和免疫组化染色检测特异性黏蛋白 MUC5AC 的表达。 1.)3.)1 印迹细胞学检查及 PAS 染色将孔径为 0.)2μg/mLm 的醋酸纤维膜剪成 3mm×3mm 大小,浸入蒸馏水 3~4h,以消除滤纸表面活性,取出晾干高压消毒备用。检查前结膜囊先滴 1%爱尔卡因 1 滴,5min 后,滤纸吸去穹隆部泪液,将醋酸纤维膜的粗糙面贴于距上方角膜缘 2mm 的球结膜表面,轻轻加压,3~5s 之后撕下,然后于其左右相邻的区域再各贴一 张,φ=95%乙醇固定 10~30min,然后依次用 0.)5%高碘酸氧化,过碘酸希夫染色剂 (HyperioumssampsoniiHance)periodicacidSchiffstaining,PAS)染色,偏重亚硫酸漂洗,苏木素复染,二甲苯透明,中性树