海藻硫酸多糖制备及抗凝血研究论文

摘要:海藻硫酸多糖是从海藻中提取的一类生物活性多糖,迄今已提取出多种具有抗凝 血活性的海藻硫酸多糖,它作为一种有望替代肝素的新型抗凝血活性物质日益受到关注。现 就目前国内外对海藻硫酸多糖的制备及其抗凝活性的研究进展作一综述。 关键词:海藻;硫酸多糖;抗凝血 中图分类号:R282.77 文献标识码:A 文章编号:1672-979X(2007)08-0054-03 海藻硫酸多糖(sulfatedpolysaccharideformseaweed,SPS)是从海藻中提取的多糖 硫酸化衍生物,是多糖分子链中单糖分子的部分羟基被硫酸根取代而形成的一类多功能活性 物质,由不同的单糖基通过糖苷键(一般为 C1,3-键和 C1,4-键)相连而成。SPS 的来源不同, 其糖基单体及硫酸基的位置也不相同。研究表明,SPS 具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂、降血 糖、抗凝血以及增强机体免疫机能等生物学活性,日益受到关注。目前常用的抗凝药物是从 动物体中获得的肝素,其来源有一定限制。SPS 抗凝血活性显着,来源广泛且无副作用,有望 代替肝素成为新型的抗凝血药物。临床资料表明,SPS 对缺血性心脑血管疾病及高血黏度综 合征有明显的抗凝、解痉、解聚、降压降脂、降低血液黏度以及扩张血管、改善微循环的 作用。 1.SPS 的来源 1913 年 Killing 首次从褐藻中提取了具有抗凝血活性的 SPS,1957 年 Springer 等报 道,从墨角藻中分离到的褐藻多糖硫酸酯在体内和体外都表现出了强抗凝血活性。1958 年 Gerber 从胶质石花菜(Gelidiumcartiagenium)中提取了呈高度硫酸化的 SPS。在很长 一段时间内人们认为,具有抗凝血活性的硫酸多糖主要是从褐藻中提取的岩藻聚糖和从红藻 中提取的卡拉胶,绿藻中没有抗凝血硫酸多糖。直到 1985 年 Deacon 报道,绿藻 Codiumfragilessp.tomentosides 中有抗凝血活性多糖,人们才开始将目光转向绿藻,并 从刚毛藻、蕨藻、孔石莼等绿藻中发现了含量很高的硫酸多糖。表明硫酸多糖在海藻中普 遍存在,来源非常广泛。 2.SPS 的制备 SPS 制备的主要工艺环节包括破碎、浸提、沉淀、纯化、水解等。浸提及沉淀是影响 收率、产品质量及经济性的主要环节,纯化与水解则是关系到其生理活性的重要因素。 2.1 粗多糖的制备 目前制备粗多糖多用水提醇沉法。通常是用热水浸提破碎的海藻,离心得到上清液,浓 缩并加入 60%~75%乙醇沉淀多糖。离心后再用乙醚、丙酮、无水乙醇等反复洗涤,干燥 即得粗多糖。也可用微波、超声波以及反复冻融等方法辅助提取,以提高多糖的提取率并缩 短提取时间。此外,还可用稀酸、稀盐溶液提取或复合酶-热水浸提相结合的方法提取,但提 取条件不能过分强烈以免破坏其天然高级结构,或造成硫酸基团脱落而丧失生物活性。提取 硫酸多糖一般不用碱溶液,因为碱处理易使 SPS 的硫酸基团脱落,用稀酸提取则不存在这个 问题。吴永沛[1]报道,提取福建产海带岩藻聚糖的条件是用 8 倍 0.1mol/L 盐酸提取 2h,70%乙醇沉淀精制,岩藻聚糖的提取率为 2.1%,产品 SO42-含量为 20%。工艺条件温 和,不使用有害元素或化学品,产品安全度高、生物活性强。酶法提取多用纤维素酶或果胶 酶使细胞破壁以提高收率,酶解法具有条件温和、杂质易除去等优点。 提取液含有褐藻胶时,可先用低浓度的乙醇沉淀褐藻胶,再用高浓度的乙醇沉淀硫酸多 糖。还可用氢氧化铅、氢氧化铝以及季胺盐类阳离子表面活性剂沉淀多糖。 2.2 硫酸多糖的纯化 沉淀所获得的多糖常含有较多的蛋白质,可选用 Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯醋 酸法或是蛋白酶水解法脱去蛋白质,得到多糖粗品。Sevag 法操作繁琐,多糖损失量大,且有 有机溶剂残留;三氯醋酸法反应剧烈,易使糖苷键断裂;蛋白酶法不仅脱蛋白效率高而反应条 件温和,多糖不易破坏或损失。文献[2]报道,用碱性蛋白酶脱除多糖中的蛋白质,脱除率可达 86.4%,多糖收率为 89.3%;Sevag 法的蛋白质脱除率虽然达 87.9%,但多糖收率仅为 28.6%。 进一步的分离纯化多采用色谱柱层析法,纯化硫酸多糖多用弱阴离子交换柱层析,如 DEAE-cellulose-52[3],DEAE-SepharoseFF[4]等。根据所带电荷的不同可用不同浓度 的盐溶液分离硫酸多糖,然后根据相对分子质量大小用葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶柱层析进一 步分离纯化。Yasantha[5]研究褐藻 Eckloniacava 硫酸多糖的抗凝血活性时,使用两次 DEAE-纤维素层析柱得到单一的洗脱峰,再用 Sepharose4B 柱层析再次纯化,经琼脂糖凝 胶电泳检测为相对单一的组分。 2.3SPS 的水解 天然的 SPS 是一种含有多种单糖和硫酸基的水溶性杂多糖,其相对分子质量从几万至 几十万不等,结构复杂,难吸收。用适当的方法降低海藻硫酸多糖的相对分子质量,是亟待解 决的问题。降解 SPS 可用酸解法、碱解法、盐解法、酶解法、超声波降解和射线降解,但 这些方法对多糖的降解大都是随机的,所得降解产物相对分子质量范围较大;专一性的糖苷 酶因价格昂贵不适合大规模工业生产。王琪琳等[6]用自由基方法降解海带硫酸多糖,可使 多糖的相对分子质量降低到 1 万左右,不但相对分子质量很集中,而且降解之后海带硫酸多 糖的多糖含量、硫酸根含量均增加,而单糖组成及多糖结构基本没有变化;Elisa[7]用 H2O2 降解 Schizymeniabinderi 中的硫酸多糖,得到相对分子质量约 8.5×103 的片断,且具有 抗凝血活性;马夏军[8]用超声波辅助 H2O2 降解麒麟菜硫酸多糖,降解后不需处理氧化剂, 相对分子质量为 5×103~4×104,水溶性明显增强,且活性基团得以较好地保留。 3.SPS 多糖抗凝血作用机制 SPS 抗凝血的机制与肝素类似,它能提高抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的活性,抑制凝血过程中必需 的丝氨酸蛋白酶、凝血酶和活化因子(FXa)的活性。Church[9]的研究表明,岩藻聚糖浓度 为 10μg/mLg/mL 时可激活肝素辅助因子Ⅱ(HCⅡ),使 HCⅡ 介导的抗凝血酶活性提高超过 3500 倍,而对的 ATⅢ 介导凝血酶的活化因子无太大影响,表明岩藻聚糖主要通过增强 HCⅡ 发挥了 抗凝血的作用;Takashi[10]认为,昆布硫酸多糖能显着抑制内源性途径和外源性途径凝血 酶的产生,它主要是抑制凝血酶的产生过程,而不是抑制凝血酶的活性。此外,还有研究表明, 低相对分子质量岩藻糖可加强 ATⅢ 和 HCⅡ 对凝血酶的抑制作用[11];从绿藻 Codiumcylindricum 中提取的硫酸半乳糖体虽没有增强 ATⅢ 和 HCⅡ 的活性,但可以直接 抑制凝血酶活性以及血纤维蛋白的聚合[12]。 4.影响 SPS 抗凝血活性的主要因素 影响 SPS 抗凝血活性的因素很多。不同来源的硫酸多糖抗凝血的活性会有很大差别。 Yasantha[5]比较了 7 种褐藻硫酸多糖的抗凝血活性,发现 E.cava,S.horneri 以及 S.coreanum 的抗凝血活性最强,其它 4 种褐藻的抗凝血活性则较弱;Maria[13]研究了红 藻 Gelidiumcrinale.硫酸多糖的结构与抗凝血活性的关系,发现 2,3-二硫-α-半乳糖单元可 增强抗凝血作用;Yasantha[5]测定了褐藻硫酸多糖酶解后多糖片断的 APTT、TT 和 PT 活 性,结果表明,相对分子质量大于 3×104 的片断表现出高抗凝血活性;Shanmugam 等[14] 的研究表明,相对分子质量为(0.05~1)×104 的岩藻聚糖有抗凝血活性,相对分子质量大于 8.5×104 的片断则没有抗凝血活性;Susanne 等[15]研究表明,硫酸多糖抗凝血活性与相 对分子质量呈哑铃型曲线关系;Mariana[16]指出,呈线性结构的硫酸半乳糖体的抗凝血活 性依赖于所带的电荷量、单糖的组分、硫酸基和糖苷键的位置等;Groth 等[17]比较相同取 代条件下硫酸化纤维素和磷酸化纤维素的抗凝血活性,发现后者的最低抗凝血浓度为 2~5mg/mL,是前者的 100 倍;若以四元胺基取代硫酸化纤维素中的硫酸基,则其原有的抗 凝血活性全部消失。表明虽然同为负电荷的取代基,其产生生物学活性的效果不同,硫酸根 更能诱导抗凝血活性;Mulloy 等[18]通过核磁共振分析发现,保持硫酸基取代度不变,将硫酸 软骨素 BC4 位上的硫酸基变为 C6 位硫酸基,其抗凝血活性完全丧失,表明 C4 位上的硫酸基 发挥着抗凝血作用;王静凤等[19]的研究表明,枝管藻多糖普遍具有抗凝血作用,且有明显的 量-效依赖关系;施志仪[20]指出,褐藻糖胶有明显的抗凝血作用,且静脉注射的效果明显好于 腹腔注射。由此可见,影响 SPS 抗凝血活性的因素主要有硫酸多糖的来源、结构、相对分 子质量大小、糖苷键的连接形式、单糖组成、硫酸基的含量与位置以及硫酸多糖的用量与 摄入方式等。 5.应用开发前景 全世界的藻类约 3 万余种,迄今被人们广泛利用的主要是红藻、绿藻和褐藻 3 大类,约 100 余种。大量研究表明,SPS 具有抗凝血活性,它具有抗血栓形成和溶解血栓的双重作用, 在溶栓的同时能防止新的血栓形成,这是目前临床应用的抗凝血剂和溶栓剂都不具备的特点, 所以,SPS 有望取代肝素成为抗凝血药物的新来源。中国海洋大学药物所已经利用褐藻胶研 制出多糖硫酸酯(PSS)、甘糖酯(PGMS)等治疗心脑血管疾病的药物。我国有丰富的海藻资 源,在开发具有抗凝血活性的 SPS 方面有着广阔的发展前景。 【摘要】目的分析中药注射剂不良反应的特点及成因,促进中药注射剂在临床的合理应 用。方法查阅近年来部分药学期刊中报道的中药注射剂不良反应病例,整理分析。结果总结 出了中药注射剂不良反应的特点及成因。结论中药注射剂的不良反应呈现出多发性和普遍 性、临床表现多样性、不可预知性、种类不确定性、批间差异性等特点,情况较为严重,临 床上应加强其合理应用。 【关键词】中药注射剂不良反应合理应用 近年来,中药注射剂的品种增多及应用逐渐广泛,中药注射剂的不良反应也相应增多。 据报道中药注射液的不良反应约占涉及到品种的 10%。 本文就近年来药学期刊中报道的中药注射液不良反应病例做一分析如下。 1 中药注射剂不良反应的特点 1.1 不良反应的多发性和普遍性几乎所有的中药注射剂,如板蓝根、穿心莲、柴胡、双 黄连粉针、清开灵、茵栀黄、葛根素、复方丹参滴注液、参附注射液、丹红注射液、黄芪 注射液、刺五加注射液、参麦注射液、银杏叶注射液、灯盏花素注射液均出现过不良反应, 有的甚至相当严重。据不完全资料分析,在中药不良反应的报道中注射剂发生的例次较口服 制剂和外用药既多又重。王前等[1]统计 1996~2005 年 85 种药物中报道的中药注射液不 良反应达 818 例,其中双黄连粉针 129 次,茵栀黄注射液 91 次,清开灵注射液 126 次,复方 丹参注射液 80 次。这显然与这些药品使用率较高有关。除以上提及不良反应报道的较多 的品种外,刺五加注射液、柴胡注射液、葛根素注射液、参麦注射液等均有不良反应报道。 由于我国不良反应监测体系尚不完善,所报道的病例远远不能反映中药注射剂不良反应的现 实情况。 1.2 不良反应临床表现的多样性中药注射剂不良反应常涉及多系统、多器官。报告较 多的是心血管系统损害,如心律不齐、心动过缓、心功能衰竭、休克、血压恶性变化、冠状 动脉粥样硬化、静脉炎、房室传导阻滞、心绞痛等症状。其次是血液系统损害如白细胞减 少、紫癜、再生障碍性贫血、弥漫性血管内凝血、粒细胞减少、多脏器出血等症状。涉及 到呼吸系统损害如哮喘、呼吸抑制、急性肺水肿等症状;消化系统损害如肝功能异常、消化 道出血、腹泻、呕吐;皮肤黏膜损害如皮疹、疮型表皮松懈型药疹、口腔溃疡;神经系统损 害如头痛、幻觉、锥体外系反应、末梢神经炎、抽搐、肌肉震颤、剥脱型皮炎、球结膜出 血,性机能低下等多种临床表现[2]。 1.3 不良反应的不可预知性由于中药成分中过敏反应物质的不确定性及过敏种类众多, 无法通过预试验减少,因而中药注射剂的不良反应存在不可预知性。 1.4 不良反应种类的不确定性现在还不能确切地知道一种中药注射剂可能会发生多少 种不良反应,如复方丹参注射液有报道的不良反应临床表现多达十几种[2]。 1.5 批与批之间不良反应的差异性由于工艺技术条件和药材质量,制剂质量标准控制水 平的制药,不同厂家、不同批次的中药注射剂发生不良反应的类型可能不同,无法做出较为 确切的结论[3]。 2 中药注射剂不良反应的成因 2.1 患者个体差异具有过敏体质的患者出现过敏反应通常与药品质量及用药剂量无关, 他们在正常剂量或小于正常剂量的情况下即可发生严重的过敏反应。章兰云[4]报道 1 例患 者肌注柴胡注射液 2~3min 后发生过敏性休克,经查该患者既往有青霉素过敏史。 2.2 剂型与给药途径中药注射剂虽然具有起效快,便于临床急症应用的特点,但由于缺少 了消化道及防御系统的处理,其引起过敏反应的可有性大大增加。所检索的 10 例柴胡过敏 反应均为其注射剂引起的。其中 8 例为严重的过敏性休克。茵栀黄引起的过敏反应 8 例,其 中 1 例为口服茵栀黄冲剂过敏,1 例为茵栀黄注射液外用引起过敏,其余均为静滴茵栀黄注射 液引起过敏。 2.3 中药注射剂的质量 2.3.1 注射剂内在质量不稳定导致疗效不稳定并影响安全性现有的中药注射剂产品绝 大多数是提取混合物,并没有分离出能够进行完全定性和定量的产品,这决定了注射剂内在 质量不稳定,导致了疗效不稳定并影响安全性。 2.3.2 药材质量不稳定导致批回差异中药注射剂所用药材,由于产地不同,受土质、气候、 采收季节等种植条件影响,药材所含成分有较大差异,不同基源的同一药材差别就更大。药 材质量的不稳定,往往造成批间不良反应差异大,反应类型也不尽相同。如同一厂家的双黄 连注射液,不同批号的不良反应类型竟分别达 20 余种[4]。 2.3.3 工艺条件不一致导致同品种不同厂家不良反应差异由于中药注射生产工艺的粗 放化,对于提取分离温度、时间、溶剂用量、溶液浓度,提取次数、滤液、滤材、容器等工 艺条件未做标准化要求,同一品种不同厂家,工艺不尽相同,造成的成分变化千差万别,导致其 临床上不良反应也有显着差异[5]。 2.3.4 质量标准不能保证质量目前我国中药质量标准很不完善,只能对所含个别成分进 行定性定量。由于中药注射剂所含成分尚不完全清楚,特别是对人体有害成分处于未知状态, 无法对所有成分均做出定性鉴别和定量测定。 2.3.5 配伍不当引起药品变质中药注射剂由于成分复杂,与其他药品配伍时容易引起药 品 pH 改变,色泽加深,发生沉淀等变化,从而引起不良反应。我们用参附注射液与葡萄糖或 生理盐水做配伍试验,结果在药品说明书标示的剂量范围内出现混浊,pH 变化和微粒增加等 现象。曹学东[6]等人报道 9 种中药注射液在生理盐水中均引起微粒数目显着增加,复方丹 参注射液在超纯水和 10%葡萄糖注射液中 pH 值显着变化,>5μg/mLm 微粒数显着增加,刺五加 注射液在 10%葡萄糖注射液中形成的>25μg/mLm 微粒不可计数[7]。这些不溶性微粒沉积在 毛细血管中可造成局部循环障碍,引起血管栓塞,产生静脉炎、肉芽肿,并可引起过敏和热原 样反应。 3 安全使用中药注射剂的几点认识 3.1 应改变中药无毒或小毒的偏见无论医生或患者都应高度重视中药注射剂不良反应 的严重性,改变中草药有病治病,无病健康的观念,认识到中药注射剂给药途径,疗效作用、安 全性等已不同于传统汤剂,它不再是传统意义上的中药,不能完全用中医药理论指导中药注 射剂的使用,更应强调其“注射剂”的概念,即使用上的安全性。 3.2 加强中药注射剂的质量监控医疗单位必须尽可能规范进货渠道,对中药注射制剂进 行必要的质量检查和质量跟踪,在使用前应注意观察注射液色泽及有无沉淀,要严格避免使 用那些存在澄明度问题的注射剂。目前,国家食品药品监督管理局已加紧实施中药注射剂指 纹图谱标准管理,将能对中药注射剂产品的稳定性、均一性做出准确的说明,减少批与批之 间的差异性,有助于不良反应的因果关系分析。 3.3 合理使用中药注射剂在使用中药注射剂时应高度警惕可能的不良反应,做好应对措 施,以防严重后果发生。 中药注射剂不是传统意义上的中药,但也应遵循辨证施治的原则。如清开灵注射液虽为 治疗温病的有效方剂,但只适用于温邪入里、内陷心包所致的高热烦躁、神昏谵语和小儿痰 热惊厥等。对发热患者,首当辨其邪在表、在里,还是半表半里。近期生产的清开灵注射液 使用说明书中注明有表证恶寒发热者慎用,正是此意。 应注意研究中药注射剂与化学药品的配伍禁忌,把不良反应的可能性尽量降到最低。 【摘要】本文测定了合成阿魏酸糖脂的抗氧化性,结果表明用 0.62%的阿魏酸糖脂浸 泡的苹果,阿魏酸葡糖酯抑制效应在处理后 4 天最明显,抑制率为 36.92%,阿魏酸木糖酯抑 制效应在处理后 8 天最明显,抑制率为 19.47%。对于果实的内源乙烯释放,经阿魏酸葡糖 酯和阿魏酸木糖酯处理的苹果分别推迟乙烯释放高峰期 6 天和 4 天。 【关键词】阿魏酸葡糖酯;阿魏酸木糖脂;抗氧化性;脂氧合酶 Theantioxygenationofferulaicacidglycolipide