中药的抗肿瘤作用研究论文

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，寻找有效的抗癌药物和方法，是世界 医学面临的重要课题。中药是祖国医学用来防治疾病的有力武器，人们发现中药治疗恶性 肿瘤，无论是在减轻临床症状，提高生存质量，防止复发转移，延长生存期，还是在与放 化疗配合，增效减毒等方面都有很好的效果。这引起了国内外学者研究中药的浓厚兴趣， 许多研究工作从不同方面揭示了各种中药的抗肿瘤作用，见表 1。 1 免疫增强作用 肿瘤的发生和发展与整个机体的免疫功能减退密切相关。临床观察表明，免疫功能活 跃的肿瘤病人比免疫功能低下的病人预后好；保持免疫记忆反应能力的病人比失去免疫记 忆反应能力的病人预后好。实验研究表明，某些中药能保护或提高机体的免疫功能，如地 黄多糖可提高 S180 荷瘤小鼠脾脏 T 淋巴细胞的增殖能力，并可较长时间维持在较高水平， 也能部分阻碍瘤株对脾脏 NK 细胞活力的抑制作用，相对改善荷瘤小鼠由于肿瘤而引起的 IL-2 分泌能力下降，显著提高 CTL 细胞活力，从而发挥抗肿瘤免疫效应（1）。杨传标 （2）等报道中药健脾康复汤（党参、白术、茯苓、薏苡仁、卷柏、仙鹤草等）治疗大肠 癌脾虚证，能增强患者免疫功能，治疗后自然杀伤（NK）细胞活性及 T 细胞亚群活性明显 增强，同时临床症状改善，生存质量得到提高。此外，中药人参、黄芪、白术等都具有很 好的增强机体免疫功能的作用。 2 诱导肿瘤细胞分化 细胞恶变是增殖和分化两者平衡的失调，从细胞增殖角度说恶性肿瘤的增殖是失去控 制的，从分化方面讲恶性肿瘤细胞是丧失分化或分化异常的细胞。诱导恶性肿瘤分化，抑 制其增殖是肿瘤现代研究的重要领域，西药中维甲酸等诱导分化剂，因有严重副作用，限 制了临床应用，而许多中药具有良好的抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化作用，且无副作用。 如丹参酮ⅡⅡ A 可诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞向终末细胞分化，并使细胞生长明显抑 制，丹参酮Ⅱ还对人宫颈癌细胞株 K562 具有良好的诱导分化作用，其效果与维甲酸相仿 （3）。曾小莉等（4）用人参总皂甙处理人肝癌细胞 HepG2 后其生长明显受到抑制，细 胞质增多，线粒体数量增加，糖原增多，高尔基复合体体积增大，发育较完善，粗面内质 网和游离核蛋白体增多，提示 HepG2 细胞趋于成熟分化。同时人参总皂甙能够有效动员 HepG2 细胞由 G1/G0 期进入 S 期，阻止 S 期细胞向 G2/M 期移行，造成大量 S 期细胞堆 积。大量该期细胞 DNA 解旋，DNA 单链暴露出更多的活性部位，为抗肿瘤药物提供更多 的作用位点。并且临床上可进一步与细胞周期特异性抗肿瘤药物联合应用，更有效地杀伤 S 期肿瘤细胞。中药淫羊藿甙作用于人高转肺癌细胞 PG，采用多种手段检测表明，淫羊藿 甙能影响 PG 细胞周期的时相分布，并能升高细胞内 cAMP/cGMP 比值；同时降低 PG 细 胞对外基质的粘附性及侵袭、运动能力，从而逆转肿瘤细胞的恶性表型（5）。 3 促进肿瘤细胞凋亡 细胞凋亡是有机体为调控机体发育，维持内环境稳定，由其内在基因编程调节，通过 主动的生化过程，使细胞自杀死亡的现象。一旦细胞的增殖或凋亡发生异常，即可导致细 胞的恶性转化形成肿瘤，而促进肿瘤细胞凋亡可能达到肿瘤缩小，癌症消退的目的。许多 研究表明，中药和化疗药的抗癌效果均与其促进肿瘤细胞凋亡有关。中药莪术中的抗癌活 性成份榄香烯能阻止肿瘤细胞从 S 期进入 G2 期，促进肿瘤细胞凋亡，榄香烯处理 HL-60 细胞 2 小时，即可发现清晰的 DNA 梯状带；处理 HL-60 细胞 24 小时，可观察到细胞凋亡 的特征性形态学改变（6）。白首乌甙 50μg/mlg/ml 作用于体外传代培养 KB 细胞 72 小时可诱 导细胞出现核固缩和早期凋亡现象；流式细胞仪测定出现凋亡峰，凋亡率高达 41.9%，并 将 KB 细胞周期阻滞于 G0/G1 期（7）。中药雄黄的的主要成份砷可促进急性早幼粒细胞 白血病细胞凋亡，使抗凋亡基因 PML-RAR 和 Bcl-2 基因表达下降（8），乳香提取物能诱 导急性粒细胞白血病细胞株 HL-60，急性单核细胞白血病细胞株 U937 及急性粒细胞白血 病原代细胞，促使其凋亡，并已用于临床治疗急性非淋巴细胞白血病，取得良好效果 （9）。 4 影响拓扑异构酶 拓扑异构酶在 DNA 复制、转录重组，以及在形成正确的染色体结构，染色体分离、浓 缩中发挥着重要作用，真核细胞 DNA 的拓扑结构由两类关键酶，即酶拓扑异构酶Ⅰ和拓扑和拓扑 异构酶Ⅱ的调节（10）。干扰拓扑异构酶是抗肿瘤的重要途径之一。如传统中药喜树树皮 中的生物碱及其衍生物能够特异性的抑制 DNA 拓扑酶Ⅰ和拓扑，使细胞周期停滞于 G2 期或生成 S 期的细胞凋亡（11）。螺旋藻提取物的水溶性成份和 DMSO 可溶性成份浓度分别为 2.3μg/mlg/ml 和 80μg/mlg/ml 时能完全抑制拓扑异构酶Ⅰ和拓扑介导的负超螺旋藻 Pbr322 解旋反应，且 水溶性成份在高浓度时可直接引起 DNA 的双链断裂（12）。表鬼臼毒素类药物能干扰拓 扑异构酶Ⅱ，抑制 DNA 重新组合且在 DNA 内引起蛋白断裂，使染色体畸变和细胞死亡。 中药蟾酥成分中的蟾毒配基之一 Bufalin 有显著抗癌效果，进一步研究表明，Bufalin 为拓 扑异构酶Ⅱ的抑制剂，主要作用于细胞周期的 S 期（13）。此外，灵芝（14）、半边旗 （15）等均对 DNA 拓扑异构酶有抑制作用从而临床上有抗肿瘤效果。 5 抑制微管蛋白活性 微管在真核细胞中呈网状分布，可以与其它蛋白共同组装成纺锤体、中心粒等，参与 细胞形态的维持，细胞运动和细胞分裂。研究表明，大量的天然和合成化合物能干扰微管 蛋白的功能，抑制微管蛋白的聚合，使纺锤体无法形成，从而使细胞分裂停止在有丝分裂 的中期。或促进微管蛋白的聚合，抑制微管解聚从而抑制细胞分裂。如紫杉醇及其衍生物 紫杉特尔等均能促使微管蛋白迅速聚集成微管，并结合到微管上抑制微管的解聚，从而使 细胞有丝分裂终止，临床研究对卵巢癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、头颈部恶性肿瘤等有 显著疗效（16）。秋水仙素、长春花碱也可以与微管蛋白结合，干扰微管的聚合和解聚 （17）。 6 抗肿瘤血管生成 实体肿瘤的生长和转移与新生血管的形成有密切关系。临床与动物实验都证明，如果 没有新生血管供应营养，肿瘤在达到 1~2 毫米直径或厚度后，即 107 个细胞左右将不再增 大而长期处于这样的微小状态，一旦新生血管形成，肿瘤得到充分的营养供给便会快速生 长，而且新生血管为肿瘤细胞经血液循环向远处转移提供了有利条件（18）。刘重贞 （19）用免疫组化法对 62 例结直肠癌组织石蜡切片进行染色和微血管计数，结果显示伴 有淋巴结转移和远处转移患者的癌组织中的微血管计数显著高于无转移的病人。肿瘤的新 生血管系统已经成为十分有希望的抗肿瘤治疗靶点，研究开发能破坏或抑制肿瘤血管生成 的药物是抗肿瘤研究中最活跃的领域之一。中医药抗肿瘤血管生成具有坚实的理论基础， 某些中药及其有效成份如十全大补汤、小柴胡汤和虫草多糖、云芝多糖、香菇多糖等均能 诱生 TNF，提高 TNF 活力（20），黄芪、党参、当归、芍药和猪苓多糖等皆可诱生 IFN（21）。TNF、INF 是促进肿瘤坏死的有效物质，其机制在于能够抑制肿瘤血管生成。 Lee 等（22）用原代培养的牛主动脉内皮细胞在Ⅰ和拓扑型胶原蛋白三维培养基中生成的毛细管 样网络结构为模型，观察中药蟾酥中的蟾毒配基 Bufalin 对血管生成的影响，绘图像分析仪 定量检测 5nmol/L 的 Bufalin 即可显著抑制毛细管的生成，FCM 分析可见血管内皮细胞阻 滞于 G2/M 期，血管内皮细胞增殖受到明显抑制。姜晓玲（23）通过比较实验发现 10μg/mlg/ ml 薏苡仁注射液对肿瘤血管生成的抑制作用非常显著，其效果优于 0.1mg/ml 维生素 E（p<0.01）。华海清等（24）报道，亚砷酸注射液有明显抗肿瘤血管形成作用，能显著 抑制内皮细胞增生，破坏血管形成中的内皮细胞的结构，降低肝癌转移模型肝移植瘤血管 内皮生长因子的表达。可见，从中药中研究抗肿瘤血管生成抑制药物具有广阔的前景。 7 调节相关基因表达 恶性肿瘤的发生发展是多因素、多阶段的复杂过程，各种肿瘤相关基因异常表达的长 期积累是癌变过程中的重要环节。因而，调节肿瘤相关基因表达成为治疗恶性肿瘤的重要 手段。实验表明，许多经临床证实有效的抗癌中药的作用机制之一就是能够调节肿瘤相关 基因的异常表达。ras 癌基因位于真核生物的细胞核中，其编码的 p21ras 蛋白，在结构和 功能上与 G 蛋白相似，与 GTP 结合后，参与细胞生长分化信号的传导。ras 基因发生点突 变后可使细胞增殖信号持续增强，导致细胞无限增殖和癌变。p53 是一个抑癌基因，正常 的 p53 基因（即野生型 p53 基因）能够抑制细胞增殖，防止发生癌变。p53 突变后丧失了 抑癌功能，而且突变的 p53 基因具有促进细胞恶性转化的作用。杨传标等（25）研究显示， 中药连黛胶囊（黄连、清黛、吴茱萸等）治疗胃肠肿瘤治疗后患者血清中 p21ras 和突变型 p53 蛋白含量显著下降，说明连黛胶囊具有调节胃肠肿瘤 ras 和突变型 p53 基因表达的作 用。bcl-2 基因有很强的抑制细胞凋亡作用，能抑制多种细胞的凋亡，有助于肿瘤生长。 bax 基因与 bcl-2 同族，在功能上二者相反，bax 的表达可加速细胞凋亡进程。二者表达的 比例程度决定细胞的生存或死亡。凌昌全等（26）发现人参皂甙能够抑制白血病细胞株 （6T-CEM）bcl-2 基因的表达，降低 bcl-2/bax 比率，从而诱导 6T-CEM 的凋亡。另有报 道（27~29），中药对 c-myc、c-fos、Rb 等等其它相关基因的表达均有很好的调节作用。 8 逆转多药耐药性 多药耐药性（multidrugresistance,MDR）是由一种药物诱发而同时对其它多种结构和 作用机制完全不同的抗癌药物也产生的交叉耐药性。MDR 是肿瘤化疗失败的主要原因之一， 临床上许多新发肿瘤化疗效果明显，化疗后复发者再次给予多种化疗方案均效果甚差，其 主要原因是肿瘤细胞因化疗产生的多药耐药性。目前公认肿瘤细胞多药耐药性产生的主要 原因是多药耐药基因编码的 P-糖蛋白（P-gp）的高度表达。克服此障碍，抗肿瘤药物的疗 效将有可能明显提高。中医药抗肿瘤细胞多药耐药有很大优势，有关的研究已经出现较好 势头，如张慧珠等（30）采用 MTT 法从多种中药单体或提取物筛选肿瘤细胞多药耐药逆 转剂，结果显示，钩藤总碱、药根碱、靛玉红对 KBv200 细胞耐药具有逆转作用，而姜黄 素与长春新碱合用在 KB 及 KBv200 细胞均有增敏作用。复方三根制剂（藤梨根、虎杖根、 水杨梅根等）对 K562/ADR 和 K562/VCR 两株细胞的多药耐药性有逆转作用，其逆转机制 是在转录水平下调 MDR1mRNA,从而降低多药耐药细胞 P-gp 的表达（31）。中药莪术的 有效成份榄香烯不但可以抑制 BEL-7402 细胞的生长，且对耐药株 BEL-7402/DOX 仍有较 强的杀伤作用。同时经榄香烯乳剂长期作用，未能诱导出 BEL-7402 细胞的 P-gp 表达，说 明已经耐药的肿瘤细胞对榄香烯仍然敏感，且不易使肿瘤细胞产生耐药性，特别适用于对 化疗药物产生耐药的恶性肿瘤治疗（32）。这些均显示了中医药在逆转肿瘤细胞多药耐药 方面的优势。现代医学研究的多药耐药逆转剂在体外实验中被证实，多数为钙拮抗剂，因 其毒副作用大，靶点单一，半衰期短等问题，难以推广于临床，更增加了研究和应用中医 药逆转肿瘤细胞多药耐药的必要性。 9 其它抗肿瘤机制 中药防治恶性肿瘤的作用机理十分复杂，在抑制端粒酶活性，抗代谢，抗浸润转移等 方面也均有报道。如陈泽雄等（33）研究表明，由莪术、半枝莲、柴胡等组成的复方在药 物浓度为 10%时对结肠癌细胞端粒酶活性的抑制能力为 50%。贯众（34）和土贝母 （35）水提物均可明显降低线粒体代谢活性，抑制肝癌细胞的生长。川芎嗪、苦参碱能明 显抑制肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，抑制粘附分子的表达，减轻内皮细胞的通透性，从而 减少肿瘤转移（36）。 10 结语 综上所述，中药抗肿瘤的作用机制是复杂的，不管是单味中药还是复方制剂，都含有 多种成份，因此其作用不是单一的，它们可能具有多方面的作用，如人参具有诱导肿瘤细 胞分化、调节肿瘤基因表达、增强免疫等多重作用。如何从多层次、多学科对中药抗肿瘤 的作用机制进行具体、客观、定性定量的研究，以进一步揭示其奥秘，尚待中医药科学工 作者的不断努力。相信，以数千年中医药理论和实践经验为基础，结合现代药物理论和生 物技术，中药的抗肿瘤作用机制研究和临床应用将会有更大的进展。 摘要复方丹参片为临床常用药物，生产厂家众多。本品的主药丹参的有效成分为脂溶 性的二萜醌类和水溶性的酚酸类成分，均具有心血管方面的药理作用，近年来研究表 明水镕性成分丹参素的扩张心脑血管，抗血小板聚集，清除氧自由基等作用较二萜醌 类的丹参酮Ⅱ更强，且水溶性成分是抗心肌缺血的主要成分。由于在药典 2000 版之前， 均未制定含量测定方法，因此对市售的复方丹参片的内在质量进行考核是有必要的。 目前，国内文献报道的本品含量的监控成分有总丹参酮Ⅱ、丹参酮ⅡⅡ A、原儿茶醛等。 在药典 2000 版中，本品含量控制的是丹参酮ⅡⅡ A，而与本品处方一致，功能与主治 也一致的复方丹参滴丸，含量控制的是丹参素，综合上述情况，在上市药品质量考核 研究中，我们对本品主成分丹参中的丹参酮Ⅱ I、丹参酮ⅡⅡ A、丹参素、原儿茶醛含量分 别进行了考核。 含量测定采用 HPIC 方法，分别建立了测定脂溶性的丹参酮Ⅱ I、丹参酮ⅡⅡ A 和水溶性的 丹参素、原儿茶醛的色谱条件，方法的线性关系的相关系数分别为 0．9998，0．9999，0．9997 和 0．9995；精密度试验 RSD 分别为 1．66％(nn＝ 6)，1．25％(nn＝6)，1．19％(nn＝6)和 2．31％(nn＝6)，加样回收率平均值分别为 101．69％，99．40％，9g．91％和 99．39％。本试验考核了三个厂家四个样品， 对测定结果分别进行了单因素方差分析，结果显示：四种样品的丹参酮Ⅱ I、丹参酮Ⅱ Ⅱ A、丹参素的含量有非常显著性的差异(nP＜0．01＝，原儿茶醛的含量无显著性差 异(nP＞0．05)。且丹参酮ⅡⅡ A 的含量均未达到药典 2000 版规定(n不得少于 0，20mg／ 片)，低的仅为 36．4％，高的为 82．80％，相差较大。复方制剂中各有效成分的含 量差异较大，势必将影响临床疗效，因此，应该加强中药复方制剂的质控方法研究。 关键词复方丹参片质量考核 HPLC 复方丹参片为临床常用药物，生产厂家众多。由于在药典 2000 版之前，均未制定含 量测定方法，因此对市售的复方丹参片的内在质量进行考核是有必要的。目前，国内 文献报道的控制本品含量的监控成分有总丹参酮Ⅱ、丹参酮Ⅱ BA、原儿茶醛等，在药典 2000 版中，本品含量控制的是丹参酮ⅡⅡ A，而与本品处方一致，功能与主治一致的复 方丹参滴丸，含量控制的是丹参素，综合上述情况，在上市药品质量考核研究中，我 们对本品主成分丹参中的丹参酮Ⅱ I、丹参酮ⅡⅡ A、丹参素、原儿茶醛含量分别进行了考 核。现将结果报告如下。 1 考核样品来源：北京市药学会提供的上市药品质量考核品种，三个厂家四个品种。 2 仪器设备和试剂 2．1 仪器 HPll00 高效液相色谱仪：G1311A 四元泵，G1322A 在线脱气体，G1313A 自动进样器，G1316A 柱温箱，G1314A 可变波长检测器，HPCHEM 色谱工作站。 TCQ250 超声波清洗器(n北京医疗设备二厂) 2．2 试药化学对照品：丹参酮Ⅱ I，丹参酮ⅡⅡ A，原儿茶醛(n中国药品生物制品机检定所)； 丹参素(n天津天土力制药集团有限公司提供)；甲醇、乙氰为色谱试剂，其余试剂均未 分析纯。 3 方法与结果 3．1 色谱条件 3．1．1 丹参酮Ⅱ I、丹参酮ⅡⅡ A：色谱柱：HypersilODS 柱(n250×4．0mm，5μg/mlm)；流 动相：甲醇：水(n77：33)；流速：1．5ml／min；检测波长：270nm；柱温：40℃。 在此条件下丹参素、原儿茶醛完全分离，且峰型稳定。 3．1．2 丹参素、原儿茶醛；色谱柱 HypersitODS 柱(n250×4．0mm，5μg/mlm)：流动相： 甲醇：乙氰：1％冰醋酸(n含 0．04％IPRB7 试剂)为 10；2：88；流速；1．0m1／ min；检测波长：280nm；柱温：40℃．在此条件下丹参素、原儿茶醛完全分离，且 峰型稳定． 3．2 标准曲线制备 3．2．1 丹参酮Ⅱ I、丹参酮ⅡⅡ A 标准曲线分别取丹参酮Ⅱ I 和丹参酮ⅡⅡ A 对照品质量，精 密称取，加甲醇适量，超声 15min 使溶解，再加甲醇制成浓度为每 1m1 含丹参酮Ⅱ I 和 丹参酮ⅡⅡ A 各 80µgg 的对照品溶液 I。精密吸取对照品溶液 I 加甲醇稀释，制成每 1mI 含丹参酮Ⅱ I 和丹参酮ⅡⅡ A10，20，30，40，50，60µgg 的标准品，置自动样器，按 3．1．1 项条件，自动进样 10μg/mll，进行色谱分析，以峰面积 y 对进样浓度 C(nμg/mlg／m1) 回归，求得回归方程，线性关系良好，见表 1。 3．2．2 丹参素和原儿茶醛标准曲线分别取丹参素钠和原儿茶醛对照品适量，精密称 取，加甲醇溶解并稀释制成浓度为每 1ml 含丹参素和原儿茶醛分别为 140µgg 和 48µgg 的对照品溶液 B。精密吸取对照品溶液 H 加甲醇稀释，制成浓度分别为丹参素 7，14，28，56，112，140µgg／m1，原儿茶醛为 2．4，4．8，9．6，19．2，38．4，48．0μg/mlg／mI 的标准品，置自动样器，按 3．1，2 项条件，自动进样 10μg/mll，进行色谱分析，以峰面积 y 对进样浓度 C(nμg/mlg／mI) 回归，求得回归方程，线性关系良好，见表 1。 3．4 精密度试验