益母草碱检测论文

【摘要】目的建立益母草中益母草碱的 HPLC 检测方法。方法 C18 色谱柱,流动相:甲 醇pH=1.7 的醋酸/醋酸钠缓冲液(体积比 85∶15),15),流速 0.6mL·min-1,mL·min-1,检测波长 277nm,灵敏度 0.1AUFS,柱温 25℃。结果益母草药材中益母草碱的质量分数为 0.015%;平均回收率为 100.08%,RSD 为 0.15%。结论高效液相色谱直接检测益母草碱,简便易行,结果准确可靠。 【关键词】益母草;益母草碱;高效液相色谱法 益母草为唇形科植物益母草(LeonurusheterophyllusSweet)的干燥地上部分,以花蕾期 的地上部分的干品或鲜品入药,性味苦、辛、微寒,归肝、心包经,具有活血调经、化瘀生新、 收缩子宫之功效,主治月经不调、胎漏难产、行经腹痛及产后淤阻等证,素有“血家圣药”、“经 产良药”之称。益母草中主要含有生物碱类、二萜类、甾醇、黄酮类、有机酸、脂肪酸类等 成分。益母草中生物碱以益母草碱和水苏碱为主[1]。药理作用研究证明,益母草中的主要有 效成分益母草碱(leonurine)具有显着的直接扩张外周血管、增加血流量、抗血小板聚集活 性等作用[2],可有效的降低血液黏度和提高红细胞的变形能力,还可调经止血,保护心肌缺血 再灌注损伤。在《中国药典》[3]及各级别标准中,益母草药材和益母草制剂的质量控制均是 以总生物碱为指标,文献[4,5]则采用雷氏盐剩余比色法测定益母草中盐酸水苏碱。而对于益 母草碱的含量却没有要求,这样不能保证益母草及其制剂的安全、有效。以益母草为原料的 多种制剂,如益母草胶囊、益母草冲剂、益母草口服液、益母草浸膏、益母草片等都是临床 上的常用品,除个别品种在《中国药典》2005 年版增加了含量测定项目外,多数品种无统一 标准,有的品种则无含量测定要求,使市售的产品质量得不到保证。所以建立一个以益母草碱 为指标直接检测益母草药材及其制剂的统一的质量标准是很有意义的。本文尝试建立益母 草碱的高效液相色谱直接检测方法。 1 仪器与材料 高效液相色谱仪 LabAlliance,LabAlliance 紫外检测器 Model5000,PhenomenexC18 柱 (4.6mL·min-1,mm×250mm,5μm),Anastarm),Anastar 色谱工作站;紫外分光光度计,SHIMADZU 公 司,UV2401PC。甲醇为一级色谱纯;益母草碱对照品(购于安徽省新星药物开发有限责任公 司,纯度为 99%);益母草(购于天津市南开区协和药店,经我校中药学院中药鉴定教研室张丽 娟副教授鉴定)。 2 方法与结果 2.1 紫外光谱最大吸收测定在 200~400nm 之间进行全波长扫描,扫描图如图 1 所示,益 母草碱在 215nm 和 277nm 处均有吸收峰,最大吸收 277nm,故选用 277nm 作为高效液相测 定的波长。 2.2 色谱条件色谱柱:PhenomenexC18 柱(4.6mL·min-1,mm×250mm,5μm),Anastarm),流动相:甲醇pH=1.7 的醋酸/醋酸钠缓冲溶液(体积比 85∶15),15),流速:0.6mL·min-1,mL·min-1,检测波长:277nm,灵敏 度:0.1AUFS,柱温:25℃,进样量:20μm),AnastarL。 2.3 对照品溶液的制备精密称取盐酸益母草碱 0.6mL·min-1,mg,溶于 25mL 流动相中,摇匀,制得 0.024mg·mL-1 对照品溶液。分别取对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、5mL 溶于 5mL 流动 相中,分别摇匀,得质量浓度分别为 000240024、0.0048、0.0072、0.0096mL·min-1,、0.024mg·mL-1 的 对照品溶液。各用微孔滤膜滤过后,按““2.2.1”项下的色谱条件进样测定(HPLC 分析如图 2 所 示),测得各溶液峰面积,计算得回归方程:C=2.222×10-8A-6mL·min-1,.213×10-4,r=0.9998。益母草碱 在 000240024~0.024mg·mL-1 间呈现良好的线性关系。 图 1 全波长扫描图(略) Fig.1Wavelengthscanningofmotherwortalkaloids 图 2 对照品 HPLC 分析图(略) Fig.2HPLCchromatogramofreferencesubstance 2.4 样品溶液的制备精密称取益母草提取物粗品 2.2mg,溶于 10mL 流动相中,摇匀即得。 2.5 样品溶液的测定取样品溶液用微孔滤膜滤过后,按““2.2.1”项下的色谱条件进样测定, 测得溶液的峰面积为 1099398,计算质量分数为 10.82%,在原药材中的质量分数为 0.015%。 2.6mL·min-1, 精密度试验取同一样品溶液,按““2.2.1”项色谱条件下重复进样 6mL·min-1, 次,测得峰面积分别 为 1106mL·min-1,46mL·min-1,9、1110843、109926mL·min-1,0、1106mL·min-1,190、1103044、1112296mL·min-1,,平均峰面积为 1106mL·min-1,350.3,计算得 RSD=0.98%。表明仪器精密度符合要求。 2.7 稳定性试验取同一样品溶液于室温下在配制后的 0、2、4、6mL·min-1,、8、10、12h,按“ “2.2.1”项下的色谱条件进样测定,测得峰面积分别为 110846mL·min-1,9、1099351、1120020、1123215、111036mL·min-1,2、1109472、1137277,平均峰面积为 1115452.3,结果 RSD=1.11%,可见供试品溶液在室温条件下 12h 内稳定。 2.8 重现性试验取同一样品溶液 6mL·min-1, 份,按““2.2.1”项下色谱条件分别测定测得质量分数分 别为 10.82%、10002483%、10.79%、10.80%、10.81%、10.83%,平均为 10.81%,RSD=0.15%。 2.9 加样回收率试验取益母草碱粗制品 3.6mL·min-1,mg,用流动相溶解后,精密加入益母草碱对照 品 0.4mg,溶液适量,置于 25mL 容量瓶中,以流动相定容至刻度,摇匀。再按“样品测定方法操 作测定,测得 6mL·min-1, 次的峰面积分别为 79016mL·min-1,5、786mL·min-1,492、807343、810706mL·min-1,、799324、813338,平均峰面积为 801228,结果计算 回收率为 100.08%,RSD=1.54%。 3 讨论 3.1 波长的确定在 200~400nm 之间进行全波长扫描,发现有两个吸收峰,215nm 和 277nm,但是 215nm 有可能受到甲醇吸收的影响,而且在 277nm 处没有其他成分的干扰,所 以选择最大吸收波长 277nm 作为检测波长。 3.2 色谱条件的建立分别考察了不同体积比的甲醇水、甲醇水三乙胺、甲醇水冰醋 酸、甲醇缓冲溶液等流动相,最终选择甲醇缓冲溶液作为流动相。选择用酸性流动相,是因 为益母草中益母草碱的存在形式有可能有两种,即益母草碱单体及其盐类,利用酸性流动相可 以转化成盐类一种形式,测定时只出现单一的峰。选择缓冲溶液,是因为缓冲溶液是一个平衡 体系,比较稳定,有利于实验的进行。 3.3 本文是在完成了分离益母草碱和水苏碱的基础上实现了益母草碱的高效液相色谱 的直接检测方法,为益母草药材的质量控制及其他益母草制剂的质量控制提供了依据。该方 法简便易行,结果准确可靠