岗梅水提取物抗炎实验研究论文

【摘要】目的研究岗梅水提取物的抗炎作用。方法采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、角 叉菜胶致大鼠足跖肿胀法、大鼠棉球肉芽肿法和醋酸致小鼠毛细血管通透性增高法观察岗 梅水提取物的抗炎作用。结果岗梅水提取物能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀和角叉 菜胶所致的大鼠足跖肿胀及炎性组织中 PGE2 的生成,减少大鼠棉球肉芽肿的形成,同时对 醋酸所致小鼠毛细血管通透性增高具有显着抑制作用。结论岗梅水提取物具有明显抗炎作 用。 【关键词】岗梅;水提取物;抗炎;大鼠 Abstract:ObjectiveTostudytheantiinflammatoryactivityofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellae.MethodsThemodel sofxyleneinducedearedemainmice,hindpawedemainducedwithcarrageeninrats,granulomainducedw ithcottonballinrats,andcapillarypermeabilityincreaseinducedwithaceticacidinmicewereused toobservetheantiinflammatoryeffects.ResultsThewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaecouldinhibitx yleneinducedearedemaandcapillarypermeabilityincreaseinmice,hindpawedemaandPGE2increa seinducedwithcarrageenandgranulomainducedwithcottonballinrats.ConclusionThewatere xtractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaehassignificantanti-inflammatoryeffects. Keywords:RadixetCaulisIlicisAsprellae;waterextract;antiinflammatory;miceinflammatory;mice 岗梅是冬青科植物梅叶冬青 Ilexasprella(Hook.etArm.)champ.exBenth.的干燥根及茎。 其味苦、微甘、性凉。有清热解毒、生津止渴、利咽消肿、散瘀止痛之功,常用于感冒发热、 肺热咳嗽、热病津伤口渴等[1]。岗梅主产于两广地区(广东、广西),是多种凉茶中的主要药 味,应用较广。但目前尚未见有关岗梅水提取物抗炎作用的系统报道,笔者对岗梅水提取物进 行抗炎作用的动物实验研究,报告如下。 1 材料与方法 1.1 药物及试剂岗梅水提取物采用水煎法自制,方法为:取适量岗梅,每次用 8 倍量水煎煮 1h,共 2 次,合并 2 次水煎煮液,浓缩,备用;阿司匹林片:河北石家庄制药集团生产,批 号:041114;乌拉坦:国药集团化学试剂有限公司生产,批号:E60521;二甲苯:广东光华化学厂 有限公司生产,批号:20050218;角叉菜胶购自美国 Sigma 公司,批号:59C-0328;C-0328;青霉素和链 霉素混合液(每毫升含 800U 青霉素和 650U 链霉素)。 1.2 动物昆明种小鼠,雄性,体质量 20~24g,SPF 级,由第一军医大学实验动物中心提供, 动物合格证号:2004A063 号;SD 大鼠,雄性,体质量 150~180g,清洁级标准,由中山大学实验 动物中心提供,动物合格证号:粤检证字 2003A070。 1.3 仪器大鼠足跖容积测定装置,参照文献[2]方法定制。 1.4 方法 1.4.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响[2]取昆明种小鼠 60 只,随机分为正常对照组、模 型对照组、岗梅水提取物低、中、高剂量组、阳性对照药物(阿司匹林)组,共 6 组,每组 10 只,实验前小鼠禁食不禁水 12h,然后各组小鼠按 0.1mL/10g 体质量灌胃给药,1 次/d,共 7d,其 中正常对照组和模型对照组给等体积蒸馏水。末次给药后 30min,除正常对照组外,其余各组 小鼠于右耳正反两面涂上二甲苯 50μLL 致炎,致炎 1h 后脱颈椎处死动物,用直径 9C-0328;mm 打孔器 冲下左耳和右耳同一部位的圆片,于分析天平上称重,以两耳片重差值为炎症肿胀度。 1.4.2 对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀及炎症组织中 PGE2(前列腺素 E2)的影响[2]取 SD 大 鼠 50 只,随机分为空白对照组、岗梅水提取物低、中、高剂量组、阳性对照药物(阿司匹林) 组,共 5 组,每组 10 只。实验前大鼠禁食不禁水 12h,然后各组大鼠按 1mL/100g 体质量灌胃 给药,1 次/d,共 7d,其中空白对照组给等体积蒸馏水。末次给药后 1h,先按容积测定方法测量 各鼠右踝关节以下容积,然后于各鼠右后足跖皮下注射 ρ=1%角叉菜胶 0.1mL 致炎,分别于致 炎后 1h、2h、3h、4h 时,按原法测量右踝关节以下容积。测完后,颈椎脱臼处死大鼠,于踝 关节上 0.5cm 处剪下炎性肿胀足称重,将以上剪下的致炎足剥皮,剪碎放入 5mL 生理盐水中 浸泡 1h 后,离心足浸出液,取上清液 0.1mL,加 0.5mol·L-1KOH-甲醇液 2mL,在 50℃下异构 化 20min,用甲醇稀释至 5mL,于波长 278nm 处测定吸光度(A)值,A 值的大小反应 PGE2 的 含量。 1.4.3 对大鼠棉球肉芽肿的影响[3]取 SD 大鼠 50 只,每只大鼠按 1g/kg 体质量腹腔注射 乌拉坦进行麻醉,在各鼠的左右蹊部用碘酒消毒,75%(φ))乙醇脱碘后,各切开 1cm 长小口,用 眼科镊子将已称重为 30mg 的灭菌脱脂棉球(直径 6.5~8.5mm)一个植入皮下,每个棉球加青 霉素和链霉素混合液 0.3mL,以防感染,随即缝合皮肤。将所有大鼠随机分为空白对照组、岗 梅水提取物低、中、高剂量组、阳性对照药物(阿司匹林)组,共 5 组,每组 10 只,实验前大鼠 禁食不禁水 12h,术后 2h 开始按 1mL/100g 体质量灌胃给药,其中空白对照组给等体积蒸馏 水,1 次/d,共 7d。在第 8 天杀死动物,打开原切口,将棉球连同周围结缔组织一起取出,剥出周 围已包裹肉芽组织的棉球,剔除脂肪组织,在 60℃烘箱放置 12h 后称重,减去原棉球重量即为 肉芽肿净重。 1.4.4 对醋酸致小鼠毛细血管通透性增高的影响[3]取昆明种小鼠 50 只,随机分为空白对 照组、岗梅水提取物低、中、高剂量组、阳性对照药物(阿司匹林)组,共 5 组,每组 10 只,实 验前小鼠禁食不禁水 12h,然后各组小鼠按 0.1mL/10g 体质量灌胃给药,1 次/d,共 7d,其中空 白对照组给等体积蒸馏水。末次给药后 1h,各组小鼠尾静脉注射 0.5%伊文思蓝生理盐水溶 液 0.1mL/10g 体质量,随即 ip0.6%(φ))醋酸 0.1mL/10g 体质量,20min 后,断头放血处死小鼠, 腹腔注射 6mL 生理盐水,轻揉腹部,收集腹腔洗出液,1000r/min 离心 5min,取上清液用紫外可见分光光度计于 59C-0328;0nm 处测吸光度值(A 值)。 1.5 统计学处理实验数据以±ss 表示,采用 SPSS 统计软件进行统计学处理,以 P<0.05 为 差异有显着性。 2 结果 2.1 岗梅水提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响岗梅水提取物中、高剂量组的耳重 差与模型组比较,差异具有显着性(P<0.01),说明岗梅水提取物能抑制二甲苯所致的小鼠耳廓 肿胀,提示岗梅水提取物对急性炎性肿胀具有抑制作用。见表 1。 2.2 岗梅水提取物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀及炎症组织中 PGE2 含量的影响低、中、 高剂量岗梅水提取物对角叉菜胶致炎后 1h、2h、3h、4h 时大鼠的足跖肿胀及炎症组织中 PGE2 含量增加均具有明显的抑制作用(P<0.05 或 0.01),提示岗梅水提取物对急性炎性肿胀 具有显着抑制作用。见表 2。 2.3 岗梅水提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响岗梅水提取物低、中、高剂量组的棉球肉 芽肿净重与空白对照组比较,差异具有显着性(P<0.05 或 0.01),说明岗梅水提取物组能明显 抑制大鼠棉球肉芽肿的形成,提示岗梅水提取物具有一定的抗炎作用。见表 3。 2.4 岗梅水提取物对醋酸致小鼠毛细血管通透性增高的影响岗梅水提取物低、中、高 剂量组腹腔洗出液的吸光度值与空白对照组比较,差异具有显着性(P<00505 或 0.01),说明岗 梅水提取物组能明显抑制醋酸致小鼠毛细血管通透性增高,提示岗梅水提取物对炎性过程中 毛细血管通透性增高具有一定的抑制作用。见表 4。 表 1 岗梅水提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(略) Tab.1TheeffectsofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeonxyleneinducedearedemainmice 与模型对照组比较:**P<0.01;与正常对照组比较:#P<0.01(tP<0.01(t 检验) 表 2 岗梅水提取物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀及炎症组织中 PGE2 含量的影响(略) Tab.2TheeffectsofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeonhindpawedema andPGE2increaseinducedwithcarrageeninrats 与空白对照组比较:*P<0.05;**P<0.01(t 检验) 表 3 岗梅水提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响(略) Tab.3TheeffectsofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeongranulomainduc edwithcottonballinrats 与空白对照组比较:*P<0.05;**P<0.01(t 检验) 表 4 岗梅水提取物对醋酸致小鼠毛细血管通透性增高的影响(略) Tab.4TheeffectsofthewaterextractfromRadixetCaulisIlicisAsprellaeoncapillarypermea bilityincreaseinducedwithaceticacidinmice 与空白对照组比较:*P<0.05;**P<0.01(t 检验) 3 讨论 岗梅为两广地区的药材,有清热解毒、生津止渴、利咽消肿、散瘀止痛之功,民间多用于 凉茶。关于岗梅现代研究的文献报道较少,化学研究表明:岗梅中含有三帖皂苷、内酯、生物 碱、赪酮甾醇、赪酮甾醇 3inflammatory;miceOinflammatory;miceβDinflammatory;miceDinflammatory;mice葡萄糖苷、丁香脂素、丁香脂素inflammatory;miceOinflammatory;miceβDinflammatory;miceDinflammatory;mice葡萄糖苷和 19C-0328;inflammatory;mice 去氢乌索酸。现代药理学研究表明:岗梅在体外试验中对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌有 抑制作用;可增加豚鼠离体心脏冠脉流量和心收缩力;对垂体后叶素所致家兔急性心肌缺血 T 波改变有保护作用[1,4]。但与岗梅“清热解毒”功效密切相关的抗炎作用未见系统的研究报 道。 炎症是机体活组织在各种损伤刺激下所表现的以防御为主的反应,炎症渗出、组织肿胀 是炎症早期的重要指标,在炎症晚期和慢性炎症期,表现为巨噬细胞和成纤维细胞增生,形成 肉芽组织[5]。 本研究采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀法、大鼠棉球肉芽肿 法和醋酸致小鼠毛细血管通透性增高法等经典动物实验方法,考察岗梅水提取物对炎症发生 的早期和晚期的影响。结果表明:岗梅水提取物既可抑制炎症早期的水肿和渗出,又可抑制炎 症晚期的组织增生和肉芽组织的生成,且能降低局部炎症组织中 PGE2 含量,提示岗梅水提 取物具有显着的抗炎作用,且其抗炎机制之一可能与减少炎症组织中 PGE2 合成有关。本研 究对岗梅清热解毒的功效进行了有益的探索,其实验结果为岗梅及相关凉茶的应用提供了一 定的实验依据,但岗梅水提取物抗炎的作用机制及水提取物中发挥抗炎的物质基础尚需进一 步研究。 【摘要】目的观察安贺拉滴眼液应用于兔干眼症治疗的免疫病理学变化,初步探讨安贺 拉滴眼液治疗干眼症的可能机制。方法新西兰白兔 20 只,制作碱烧伤干眼模型,随机分为对 照组和安贺拉组,分别滴生理盐水和安贺拉滴眼液。用药 4 周后应用印迹细胞学和免疫病理 学方法检测结膜杯状细胞密度、MUC5AC 阳性细胞率和炎性细胞浸润密度。结果对照组结 膜炎性细胞浸润密度高于安贺拉组,安贺拉组杯状细胞密度和 MUC5AC 阳性细胞率均大于 对照组(P<0.05)。结论安贺拉滴眼液可以降低兔眼表的炎症反应,促进杯状细胞增殖,在干眼 症治疗方面具有一定的应用前景。 【关键词】安贺拉滴眼液;干眼症;兔;免疫病理学 Abstract:ObjectiveTodiscussthemechanismofketorolactromethmineeyedropsinrabbits dryeyewithalkaliburnsinconjunctivabyobservingtheimmunopathologicprocessafteritwasus ed.MethodsTwentyrabbitmodelswereestablishedbyburningwithalkaliinconjunctiva,andthen dividedintotwogroupsrandomly:theexperimentalgrouptreatedwithketorolactromethmineey edropsandthecontrolgrouptreatedwithsaline.Byusingimmunopathologictechniquesandimp ressioncytologytest,densityofgobletcell,positiverateofMUC5ACanddensityofinflammatoryc ellinconjunctivawerestudiedthe4thweekafterdrugused.ResultThedensityofgobletcell,andp ositiverateofMUC5ACinexperimentalgroupwashigherthanthatofcontrolgroupandlowerinthe densityofinflammatorycell(P<0.05).ConclusionKetorolactromethmineeyedropscanreduceo cularsurfaceinflammationandincreasethenumberofgobletcellsinrabbits,suggestingitisvalua bletodryeye. Keywords:ketorolactromethmine;dryeye;rabbit;immunopathology 干眼是指任何原因引起的泪液质或量及动力学的异常,导致泪膜不稳定和(或)眼表面的 异常,并伴有眼部不适症状的一类疾病。干眼的主要症状有眼部干燥、异物感、视疲劳、畏 光及视力下降等,轻者影响工作和生活,严重者可导致眼表尤其是角膜组织干燥、融解、穿孔, 严重危害视功能[1]。干眼作为最常见眼表疾病有日趋增多的趋势,其药物治疗方法多种[2]: 泪液替代疗法、黏液溶解药、局部自家血清、抗生素等。随着干眼发病机制的深入研究,现 已认识到由炎症介质介导的炎症反应参与几乎所有类型干眼的病理生理过程。本研究采用 新型药物——安贺拉滴眼液作用兔干眼模型,研究其疗效及可能的作用机制。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 LeicaMEL53 型眼科手术显微镜(瑞士 WILDLEITZ 公司),YZinflammatory;mice5CSI 型裂隙灯显微镜(苏州医疗仪器厂),Olympusinflammatory;mice10AK 照相显微镜(日本欧林巴斯光学公司),低 温恒冷切片机(美国 Leica 公司),安贺拉滴眼液(Acular,美国 Allergan 公司产品),16mm×6mm 的滤纸条,1mol/L 的 NaOH(广州化学试剂厂),1%荧光素钠溶液,1%虎红溶液(广西梧州制药 股份有限公司),免疫组化试剂盒和 MUC5AC 抗体(美国 Sigma 公司)。 1.2 动物选择与分组健康成年新西兰白兔 20 只,雌雄各半,体质量 2.0~2.5kg。随机分为 实验组和对照组,每组 10 只,右眼为实验眼。购自广东省医学实验动物中心,合格证 号:SCXK(粤)2003-0002,粤监证字 2006A001。 1.3 实验方法 50mg/2mL 盐酸氯丙嗪+100mg/2mL 氯氨酮肌肉注射麻醉兔,切除右眼第 三眼睑,并用 2 张 16mm×6mm 的滤纸条蘸 1mol/L 的 NaOH 溶液置于距兔角膜缘上方 2mm 的结膜上,9C-0328;0s 后立即用 100mL 生理盐水反复冲洗结膜囊。术后对照组局部应用生理盐水滴 眼,每日 3 次;实验眼局部应用安贺拉滴眼液,每日 3 次。用药 4 周后行结膜印迹细胞学检查, 并取病变区结膜行组织病理学检查和免疫组化染色检测特异性黏蛋白 MUC5AC 的表达。 1.3.1 印迹细胞学检查及 PAS 染色将孔径为 0.2μLm 的醋酸纤维膜剪成 3mm×3mm 大小, 浸入蒸馏水 3~4h,以消除滤纸表面活性,取出晾干高压消毒备用。检查前结膜囊先滴 1%爱 尔卡因 1 滴,5min 后,滤纸吸去穹隆部泪液,将醋酸纤维膜的粗糙面贴于距上方角膜缘 2mm 的球结膜表面,轻轻加压,3~5s 之后撕下,然后于其左右相邻的区域再各贴一张,φ)=9C-0328;5%乙醇 固定 10~30min,然后依次用 0.5%高碘酸氧化,过碘酸希夫染色剂 (periodicacidSchiffstaining,PAS)染色,偏重亚硫酸漂洗,苏木素复染,二甲苯透明,中性树脂封 片,置于双目光学显微镜下观察上皮细胞的连接,胞核胞浆的颜色,核浆比例(N/C),上皮细胞角 化以及杯状细胞密度。 1.3.2 组织病理学检查用药 4 周取病变部位球结膜,生理盐水冲洗干净后放入 10%甲醛 固定液固定。流水冲洗固定组织过夜。依次进行乙醇梯度脱水,φ)=70%乙醇 15s,80%、9C-0328;0%、9C-0328;5%、100%乙醇各 3h。二甲苯透明 3 次,每次 10min。从低熔点石蜡到 高熔点石蜡浸蜡共 3 次,每次 1h。将浸蜡后的组织放入包埋盒内,倒入熔化的高效切片石蜡, 待凝固后取出石蜡块。将石蜡块安装在切片机的组织固定架上用,调节切片厚度在 4~6μLm 每个石蜡块切 2~3 张切片。 1.3.3 免疫组织化学染色将组织片放入 20℃温水中展开,贴于玻片上,放入烘箱内烘干 5min,依次放入二甲苯脱蜡和 9C-0328;5%乙醇各 2 次,每次 1min。PBS(0.01mol/L,PH7.4)漂洗 3min×3;4℃1%Trisinflammatory;miceTriton100 通透 5min,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μLL 即用型过氧化物酶 阻断剂于室温下孵育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3,以消除内源性过氧化物酶的活性;加 20μLL 非免疫动物血清于室温孵育 5min,以减少非特异性背景染色;倾去血清吸去多余液体,滴加一 抗(MUC5AC)于 4℃孵育 12h,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μLL 生物素标记的二抗,于室温下孵 育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3;加 20μLL 辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素于室温下孵育 10min,用 PBS 漂洗 3min×3;加新鲜配制的 DAB 显色液显色,显微镜下观察结果,1~2min 水 洗终止反应;苏木素复染核 15~30min,染色过深者用盐酸酒精漂洗;每一批实验均设有阳性及 空白对照,阳性对照:采用已知阳性的胃癌切片(由试剂公司提供);空白对照:以 PBS 代替一抗。 1.4 结果判定 1.4.1 印迹结膜杯状细胞观测分级根据 NELSON’s 分级标准进行分级[3]:0 级:结膜上皮 细胞形态正常,层次大小一致,胞浆蓝绿色,N/C 为 1∶2,2,杯状细胞密集分布;1 级:结膜上皮细胞 轻度扩大,胞浆蓝绿色,N/C 为 1∶2,3,杯状细胞开始减少密度下降;2 级:所有结膜上皮细胞均扩 大,变扁平,胞浆蓝绿色或粉红色,N/C 为 1∶2,4 或 1∶2,5,轻度角化。杯状细胞明显减少;3 级:结膜 上皮细胞浆内出现颗粒状物质,核固缩崩解,上皮细胞胞浆呈粉红色,N/C 为 1∶2,6 或 1∶2,8,出现不