仙鱼汤对小鼠肺癌研究论文

【摘要】【目的】探讨具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中药复方仙鱼汤对小鼠 Lewis 肺癌生长的抑制作用及其相关的分子机制。【方法】将 50 只 Lewis 肺癌荷瘤小鼠分为仙鱼 汤高、中、低剂量组(剂量分别为 1.747、0.874、0.437g·kg-1·d-1),环磷酰胺(CTX))组(剂量 为 20mg·kg-1·d-1),荷瘤模型组;计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率;制备单细胞悬液,采用 流式细胞仪检测各组小鼠 Lewis 肺癌细胞周期、细胞凋亡率;采用免疫组化法检测各组 Lewis 肺癌小鼠的 bcl222 基因的表达。【结果】仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组瘤体质 量均低于模型组,肿瘤细胞凋亡率均高于模型组(P<0.05 或 P<0.01),仙鱼汤各组随着药物剂 量的增大,抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组处于 S 期的细胞比例均低于模型组(P<0.05 或 P<0.01),呈现明显的 G0/G1 期阻滞现象。仙鱼汤各 剂量组 bcl222 染色强度指数显着低于模型组(P<0.01)。【结论】仙鱼汤具有抑制小鼠 Lewis 肺癌生长的作用,其机理可能与通过降低 bcl222 表达从而促进肿瘤细胞凋亡有关。 【关键词】仙鱼汤/药理学肺肿瘤/中药疗法细胞凋亡基因表达调控细胞培养 肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,中医药在肺癌的治疗中发挥着越来越重要的 作用。仙鱼汤是治疗肺癌的经验方,具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效,多年的临床应用已证实 其具有较好的临床疗效[1-2]。本研究通过动物实验,进一步研究了仙鱼汤对小鼠 Lewis 肺癌 生长的抑制作用,并从诱导肿瘤细胞凋亡及调控凋亡相关基因的角度探讨其作用机理。现报 道如下。 1 材料与方法 1.1 动物 C57BL/6J 小鼠,雌雄各半,体质量 18~22g,SPF 级,由广州中医药大学实验动物 中心提供(合格证号:0020535)。 1.2 瘤株小鼠 Lewis 肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供,广州中医药大学第一 附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。 1.3 药物与制备仙鱼汤组成:仙鹤草 15g,鱼腥草 30g,猫爪草 30g,山海螺 30g,党参 15g, 三七片 10g,山慈菇 10g,浙贝母 15g,守宫 5g,天冬 15g,黄芪 30g,炙甘草 5g。由广州中医药 大学新药研究中心制备,按照传统煎煮法煎煮,低、中、高剂量组药物浓度根据人与动物体表 面积与计量换算法计算[3],低剂量组 1.092g/mL,中剂量组 2.184g/mL,高剂量组 4.368g/mL, 分别相当于临床等效剂量的 1、2、4 倍。制备后于 4℃冰箱中贮存备用。环磷酰胺(CTX)) 注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品(批号:20060206),200mg/支,临用前用生理盐水 溶解,稀释浓度为 2mg/mL,根据 CTX) 的半数致死量(LD50)为 472mg/kg,注射用量为 LD50 的 1/3~1/5,故小鼠给药剂量设为 20mg·kg-1·d-1。 1.4 主要试剂与仪器碘化丙啶(PI))染液为晶美生物工程有限公司产品;bcl222 兔多克隆抗 体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色(SABC)试剂盒(SA1022)均为博士德生物工程有 限公司产品;RPMI)21640 培养基为 Gibco 公司产品;二甲苯、乙醇,均为市售分析纯;超净工作 台(苏净集团安泰公司);冷冻桌面离心机(Eppendorf5810RCentrifuge);解剖显微镜(北京电子 光学设备厂);37℃电热恒温水浴箱(上海恒丰仪器仪表有限公司);ALTRA 型流式细胞仪(美国 Beckmancoul2ter 公司);CS2Ⅳ 型烤片机(孝感市电子仪器厂);亿鸣2200 病理图像分析系统(中 国亿鸣)。 1.5Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型复制于液氮罐中取出 Lewis 肺癌细胞株 1 支,置于 37℃电 热恒温水浴箱内,轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管,用酒精消毒后开启,用吸管吸出细胞 悬液,注入离心管并滴加体积分数 10%小牛血清 RPMI)21640 培养基,常规离心,制成瘤细胞混 悬液,台盼蓝计数约为 1×107/mL 瘤细胞。消毒小鼠右前腋,取 0.2mL(约 1×106~2×106 个瘤 细胞)接种于皮下。传代 3 次。在无菌条件下剥离 Lewis 肺癌荷瘤鼠皮下瘤块,选取生长良好 的瘤组织,剪碎、称质量,用细胞匀浆器制成匀浆,按体积比 1:3 加生理盐水制成瘤细胞混悬 液,接种于 C57BL/6J 小鼠右前肢腋窝皮下,每只 0.2mL(约 1×106~2×106 个瘤细胞)。 1.6 分组及给药接种 24h 后随机分为 5 组:仙鱼汤高剂量组(剂量为 1.747g/kg)、仙鱼汤 中剂量组(剂量为 0.874g/kg)、仙鱼汤低剂量组(剂量为 0.437g/kg)、CTX) 阳性对照组(剂量 为 20mg/kg)、荷瘤模型组。中药各组均予以 0.4mL 中药灌胃,CTX) 组予以 0.2mL 腹腔注射, 荷瘤模型组予以 0.4mL 生理盐水灌胃,均每日 1 次,给药 14d。 1.7 观察指标及检测方法 1.7.1 小鼠生活状态观察实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。 1.7.2 抑瘤率末次给药后 24h,Lewis 荷瘤小鼠颈椎脱臼处死,用眼科剪分离剥取肿瘤,电 子天平称质量,计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率[4]:p 抑瘤=(1-m 实验组/m 模型 组)×100%。 1.7.3 细胞周期分析及细胞凋亡检测取小块瘤组织,加入生理盐水洗净血迹后倒掉,再加 入 1mL 生理盐水,用眼科剪剪碎组织,吸管轻轻吹打,过 300 目筛,收集单细胞悬液于流式专用 管,加入 2mL 中性磷酸盐缓冲溶液(PBS),1300r/min 离心 5min 洗涤 2 次,调整细胞计数约 1×106/mL,加入体积分数 70%冰乙醇 2mL 吹打后封口固定,保存于 4℃冰箱 24h。将固定的 单细胞悬液离心,去固定液,加入 PBS 重新悬浮,洗涤 2 次,300 目筛网过滤 1 次,加入 1mLPI) 染液(终浓度 100mg/L),4℃避光染色 30min,流式细胞仪检测,收集 50000 个细胞,应用 mul2ticycl2e 软件分析凋亡率[5]。 1.7.4 病理检查肿瘤组织经体积 分数 10%福尔马林固定 24h 后常规石蜡包埋,4μmm 厚连续切片,苏木素-伊红(HE)染色, 光镜观察肿瘤生长、肿瘤坏死、间质反应和肿瘤及肿瘤周围组织炎症细胞浸润情况并摄片。 1.7.5bcl222 阳性表达检测采用免疫组化法。常规石蜡包埋后,4μmm 厚连续切片,行 SABC 法免疫组织化学染色,用 PBS 液代替一抗做阴性对照。光学显微镜下观察,bcl222 蛋白染色细 胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野(400)下随机计数 5 个视野。计算出各组的染色强度指 数(stainingintensityindex,pSI)I))。pSI)I)=(pA 强度瘤细胞×0)+(pB 强度瘤细胞×1)+(pC 强度瘤 细胞×2)+(pD 强度瘤细胞×3)。其中 A 强度代表细胞浆无特异性染色;B 强度代表细胞浆呈 特异性浅棕黄色,染色较浅;C 强度代表细胞浆呈特异性棕黄色;D 强度代表细胞浆呈特异性 深棕色,染色较深。染色强度指数(pSI)I))的范围在 0~3[6]。 1.8 统计学分析采用 SPSS11.5 统计软件处理。 2 结果 2.1 一般状况的观察实验结束后,模型组、CTX) 组小鼠表现为身体瘦小,活动少,喜聚群, 毛发缺少光泽;CTX) 组小鼠于实验 5~7d 开始出现脱毛,进食减少;仙鱼汤高、中、低剂量组 小鼠脱毛现象少于 CTX) 组及模型组,活动力优于 CTX) 组及模型组。 2.2 各组抑瘤率比较表 1 结果表明,仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组瘤体质量均低于 模型组(P<0.05 或 P<0.01)。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大,瘤体质量逐渐减轻,抑瘤率逐 渐增高。 表 1 各组 Lewis 肺癌小鼠的瘤体质量及抑瘤率比较(略) Tabl2e1Comparisonoftumormassweightandtumor2inhibitoryrateindifferentgroups 统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,P<0.05,②P<0.01,P<0.01,与模型组比较 2.3 各组细胞凋亡率及细胞周期分析仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组小鼠 Lewis 肺 癌细胞凋亡率均高于模型组(P<0.05 或 P<0.01),各仙鱼汤组随着剂量的增大,凋亡率亦逐渐 增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组处于 G0/G1 期细胞的比例均高于模型组,其中仙 鱼汤高剂量组、CTX) 组与模型组比较,差异有显着性意义(P<0.01)。仙鱼汤高、中、低剂量 组及 CTX) 组处于 S 期细胞的比例均显着性低于模型组(P<0.05 或 P<0.01),呈现明显的 G0/ G1 期阻滞现象。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX) 组处于 G2/M 期细胞的比例与模型组比 较,差异无显着性意义(P>0.05)。结果见表 2、图 1。 2.4 光镜观察模型组癌细胞大小和形态很不一致,可见瘤巨细胞;癌细胞核体积增大,细胞 核和细胞浆比例增大,核的大小、形状、染色不一,可见巨核、多核,核染色深,核染色质呈粗 颗粒状,分布不均匀;核仁肥大,数目增多,核分裂相增多,可见不对称性、多极性及顿挫性等病 理性核分裂相,间质内淋巴细胞少见(图 2-a)。CTX) 组可见大片坏死,间质见较多的淋巴细胞 等炎细胞浸润,纤维组织反应性增生(图 2-b)。仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增大,间 质可见淋巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体(图 2-c、d、e)。 2.5 各组 bcl222 染色强度指数凋亡相关基因 bcl222 的阳性产物主要位于细胞浆,可见大量 的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组 bcl222 的染色强度指数均显着低于模型组 (P<0.01),并呈剂量依赖性,而 CTX) 组与模型组比较差异无显着性意义(P>0.05)。结果见表 3、图 3。 表 2 各组小鼠 Lewis 肺癌组织的细胞凋亡率及细胞周期分析(略) Tabl2e2Comparisonofcel2l2apoptosisratioandcel2l2cycl2eanal2ysisindifferentgroups 统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,P<0.05,②P<0.01,P<0.01,与模型组比较 a.模型组 b.CTX) 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 1 各组凋亡率检测流式细胞图谱比较(略) Figure1Resul2tsofcel2l2apoptosisratiodetectedbyfl2owcytometerindifferentgroups a.模型组 b.CTX) 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 2 各组肿瘤组织形态比较(HE 染色,×400)(略) Figure2Morphol2ogical2changesoftumorcel2l2sunderl2ightmicroscopeindifferentgroups(HE staining,×400) a.模型组 b.CTX) 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 3 各组 bcl222 阳性表达比较(免疫组化,×400)(略) Figure3Positiveexpressionofbcl222indifferentgroupsdetectedbyimmunohistochemical2 method 表 3 各组 bcl222 染色强度指数比较(略) Tabl2e3Comparisonofstainingintensityindexofbcl222indifferentgroups 统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,P<0.01,与模型组比较 3 讨论 多数学者认为,肺癌发生发展的中医病机可以用"痰、瘀、虚"3 个字高度概括。其中正 虚是肺癌发生的基础,《医宗必读》云:"积之成者,正气不足,而后邪气踞之。"正虚又以脾虚 为主,"脾为生痰之源,肺为贮痰之器"。正是脾虚导致痰浊内生,进一步血停成瘀,瘀血内生,痰 瘀内阻,蕴积肺部,日久而发为本病。 广州中医药大学陈锐深教授从肺癌病因病机出发,以健脾清肺、化痰祛瘀为治疗 大法,自拟了治疗肺癌的经验方"仙鱼汤"。方中君药为党参,具有补中益气、健脾益肺、 生津养血的功效,为补益肺脾气之要药。黄芪配合党参,以补肺脾之气;浙贝母清热化痰、开 郁散结;猫爪草散结消肿;三七片化瘀散结止痛,共为臣药。仙鹤草收敛止血、解毒抗癌;鱼腥 草清热解毒、消痈排脓;天冬养阴清肺生津;山海螺解毒消肿、排脓祛痰;山慈菇清热解毒、 化痰消肿散结;守宫散结止痛,共为佐药。炙甘草调和诸药,为使药。综合全方,扶正祛邪,攻补 兼施,使祛邪而不伤正,共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。 肿瘤的发生和发展不仅与肿瘤细胞的增殖、分化异常有关,而且与细胞凋亡的调控失常 有关。人类细胞的凋亡机制十分复杂,目前已鉴定出了构成凋亡途径的多种成分,揭示出凋亡 是受多种基因调控的,例如 p53、p16、c2myc、bcl222、bax 等相关基因均参与了细胞凋亡的 调控[7]。bcl222 是一种凋亡相关基因,被激活的 bcl222 基因的主要作用是抑制细胞凋亡,下调 bcl222 基因的表达,对肿瘤细胞有显着的生长抑制作用。bcl222 可能通过阻断凋亡的公共信号 传递通路(如抑制线粒体释放细胞色素 C)达到抑制或阻断多种细胞及细胞系的细胞凋亡过 程。随着该基因蛋白产物的过度表达,使得细胞增殖与凋亡的平衡发生紊乱,从而阻断细胞凋 亡的最后共同通道,从而抑制细胞凋亡,导致癌变[8-11]。 本研究通过动物移植性肿瘤实验法探讨仙鱼汤对 Lewis 肺癌生长及肿瘤细胞凋亡的作 用。结果表明,仙鱼汤具有一定的抗肿瘤作用,而且其抑瘤作用随着剂量的增加而增强。从 HE 染色的病理切片中发现,不同剂量仙鱼汤组可见癌巢内坏死面积增大,间质可见较多的淋 巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体。进一步采用流式细胞仪检测凋亡率,结果表 明仙鱼汤具有促进小鼠 Lewis 肺癌细胞凋亡的作用,并且随着剂量的增加作用也逐渐增强。 仙鱼汤各剂量组处于 G0/G1 期细胞的比例均高于模型组,处于 S 期细胞的比例均低于模型 组,呈现明显的 G0/G1 期阻滞现象,提示仙鱼汤可能使 G1 期细胞不能通过细胞周期检测点 进入 S 期,从而发生 G0/G1 期阻滞,阻断 DNA 复制,干扰肿瘤细胞周期正常进行,以起到抑制 肿瘤的作用。免疫组化检测结果显示,仙鱼汤各剂量组 bcl222 蛋白表达均显着低于模型组,并 随着仙鱼汤剂量的加大,肿瘤组织 bcl222 的染色强度指数也逐渐降低。本研究实验结果提示 仙鱼汤可能通过降低 bcl222 表达的途径促进肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用,对临床用药 具有一定的指导意义。 【摘要】【目的】探讨金钗石斛(Dendrobiumnobil2eLindl2.)总生物碱和粗多糖对白内障 的抑制作用。【方法】采用溶剂法分离提取金钗石斛总生物碱和粗多糖;体外培养大鼠晶状 体,加入 H2O2 与总生物碱(或粗多糖)共培养 24h;分别在培养后 6、12、18、24h 共 4 个时 段于解剖显微镜下观察并记录晶状体混浊度的改变;检测晶状体水溶性蛋白、谷胱甘肽 (GSH)的含量及总超氧化物歧化酶(T2SOD)和丙二醛(MDA)的活性。【结果】金钗石斛总生 物碱和粗多糖均能减轻晶状体混浊度,并能显着升高晶状体水溶性蛋白、GSH 含量及 T2SOD 活性,降低 MDA 的活性(均 P<0.05),其中石斛总生物碱高剂量组效果最佳。【结 论】金钗石斛总生物碱和粗多糖在体外均有一定的抗白内障作用,其机制与拮抗晶状体的氧 化损伤有关,而总生物碱的效果优于粗多糖。 【关键词】金钗石斛/药理学金钗石斛/化学白内障/中药疗法晶状体/病理学器官培养 白内障(cataract)是一种常见的致盲眼病,它是多种因素共同作用的结果,氧化损伤是其 发病机制之一[1]。当前许多中药研究都是从提高晶状体抗氧化能力入手,利用抗氧化剂或抗 氧化酶激活剂来消除或中和晶状体中的氧化产物,阻止或逆转晶状体变浑浊,从而抑制或延缓 白内障的发生发展[2]。石斛是一种名贵中药材,抗白内障是其主治功效之一。已有研究证实, 石斛水煎剂可通过改变晶状体相关酶的活性而对 D2半乳糖性白内障起到防治作用[3],石斛 的乙酸乙酯提取物在体外还可抑制醛糖还原酶和过氧化脂质(LPO)的产生[4],这些研究在一 定程度上揭示了石斛抗白内障的作用机理。然而,石斛化学成分复杂,其抗白内障的具体有效 成分是什么,至今仍未见报道。本实验通过体外培养晶状体,对金钗石斛 (Dendrobiumnobil2eLindl2.)的粗提物总生物碱(total2al2kal2oids)和粗多糖(pol2ysaccharides)抗白 内障作用进行了探讨,现报道如下。 1 材料和方法 1.1 动物 4~5 周龄 Wistar 大鼠 20 只,体质量 80~120g,雌雄不限,由广州中医药大学实验 动物中心提供,合格证号:粤临证字 2007A025。 1.2 药材和试剂金钗石斛由贵州赤水信天石斛有限公司提供,经广州中医药大学中药鉴 定教研室李薇教授鉴定。DMEM 低糖培养基(杭州吉诺生物医药技术有限公司);胎牛血清(杭 州四季青生物工程材料有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS,福州迈新生物技术开发公司);体积分 数 30%过氧化氢(H2O2,浙江临安化工二厂);吡诺克辛钠滴眼液(武汉天天明药业有限责任公 司,批号:070102);Bradford 蛋白质定量试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司);谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所 产品;其他试剂均为国产分析纯。 试剂配制如下。改良碘化铋钾试剂:甲液:0.85g 次硝酸铋溶于 10mL 冰醋酸,加水 40mL; 乙液:8g 碘化钾溶于 20mL 水中;将甲液与乙液等量混合后,取 1mL 与 2mL 醋酸混合,供生物 碱的显色用。Mol2ish 试剂:甲液:α2萘酚 1g,加体积分数 75%乙醇至 10mL;乙液:浓硫酸;供多 糖的检测用。 1.3 仪器 E252AA 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZDIII2DI)I)I) 型循环水式真空泵(巩 义市英峪予华仪器厂);BS110S 型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);HI)298128 型 pH 计(北京 HANNA);SW2CJ2I)F 型超净台(苏州净化设备厂);Gal2axy2s 型 CO2 培养箱(美国 RSBiotech);ST2PT 型解剖显微镜(日本 OLYMPUS);58102R 型低温高速离心机(德国 Eppendorf);7200 型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。 1.4 金钗石斛总生物碱和粗多糖的分离提取及检识金钗石斛总生物碱和粗多糖的提取 方法参照文献[5-6]并略加改进:干燥金钗石斛切碎打成粗粉,加入体积分数为 95%乙醇 85℃ 回流提取(4h/次×3 次),合并提取液,减压回收乙醇后得到石斛浸膏,加 1moL/LHCL 调节浸膏