两性霉素B抑制白色念珠菌论文

【摘要】目的综合考察各种因素(不同的培养基、培养基的 pH 值、真菌接种浓度等)对 AmB 抑制白色念珠菌作用的影响,为临床合理用药提供理论依据。方法液体稀释法。结果 在不同的培养基中,AmB 对白色念珠菌的 MIC 值不同,随着 pH 的增高及真菌接种菌液浓度 增加,其 MIC 值增加。结论 AmB 对白色念珠菌的 MIC 值会受到多种因素的影响,所以,进行 药物的抗菌活性研究时应制定并严格执行统一的标准。 【关键词】两性霉素 B;白色念珠菌;抑制 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofvariousfactors,suchasthetypeofmediu m,Phofmedium,sizeofinoculumontheactivityofamphotericinB(AMB)againstCandidaalbican s,soastoprovideevidencesforrationaluseofthedrug.MethodsThebrothdilutiontestwasexami ned.ResultsTheactivityofAmBagainstCandidaalbicanswasinfluencedbythetypeofmedium. Theminimuminhibitionconcentrations(MIC)increasedwiththeincreaseofpHandinoculumcon centration.ConclusionThestudyofantifungalactivitymustestablishandstrictlyimplementunifi edstandard. 【Keywords】amphotericinB;Candidaalbicans;inhibition 药物的抗真菌活性受到多种因素的影响,例如,不同的培养基、培养基的 pH 值、培养时 间、培养温度、真菌接种浓度、真菌形态、血清、有氧与厌氧环境等。两性霉素 B 是目前 临床上应用的抗真菌药物,本研究是综合考察各种因素对其抑制白色念珠菌作用的影响,为临 床合理用药及进一步药用价值的开发奠定基础。 1 实验材料 1.1 菌株白色念珠菌 Cla,购于中国医学真菌保藏中心。 1.2 药品两性霉素 B(amphotericinB,AmB),上海先锋药业公司,上海第二制药厂生产。 AmB 溶于蒸馏水中制备成浓度为 1280μg/mlμg/mlg/ml 的药物原液,过滤除菌。临用时用灭菌蒸馏水 稀释为 128μg/mlg/ml 最高浓度药液。 1.3 培养基改良沙氏液体培养基(1%蛋白脉,4%葡萄糖);YEPD 培养基(2%蛋胨,2%葡萄 糖,1%酵母浸粉)。 1.4 其他 HZQ-X10μg/ml0μg/mlA 型恒温振荡培养箱(上海一恒科学仪器有限公司产 品);50μg/ml0μg/ml0μg/mlμg/mll、10μg/ml0μg/ml0μg/mlμg/mll 加样枪(法国 GILSON 产品);SN-CS-2D 单人净化工作台(苏州净化设备 厂);改良沙堡氏液体培养基(北京奥博星生物技术责任有限公司)。血球计数板、显微镜、滤 器(水质滤膜)等。 2 实验方法 2.1 不同的培养基对 MIC 值的影响取活化 2 次并处于对数生长期的白色念珠菌,用血球 计数板计数菌浓度使约为 10μg/ml5cfu/ml,以液体稀释法[1]测定改良沙氏液体培养基和 YEPD 培 养基对最低抑菌浓度的影响:(1)2~10μg/ml 管加 1ml 培养基;(2)1 管加 1ml 药液(128μg/mlg/ml),2 管加 1ml 药液(128μg/mlg/ml),然后用枪尖吹打混匀,吸取 1ml 到第 3 管,依次倍比稀释至第 8 管后弃去; (3)取上述浓度为 10μg/ml5cfu/ml 的 0μg/ml.1ml 菌液按 9→1 的顺序加入上述 9 管中,28℃培养 24h,不 搅动情况下,以培养基清晰的试管为菌株 10μg/ml0μg/ml%受抑制,此管的药物浓度即为最低抑菌浓度 (MIC)。 2.2 培养基 pH 值对 MIC 值的影响用 0μg/ml.1mol/L 甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3~5)和磷酸盐缓 冲液(pH6~8)调整沙氏培养基的 pH 分别为 3、5 和 8,然后按上述方法测定 MIC 值。 2.3 接种真菌浓度对 MIC 值的影响将浓度为 10μg/ml2cfu/ml,10μg/ml3cfu/ml,10μg/ml4cfu/ml,10μg/ml5cfu/ ml,10μg/ml6cfu/ml 的菌液接种于改良沙氏液体培养基,其余步骤与上法同,测定其 MIC 值。 3 结果 3.1 不同的培养基对 MIC 值的影响 AmB 在两种培养基中的最低抑菌浓度不同,在改良 沙氏液体培养基(pH5~6)中的 MIC 为 8μg/mlg/ml,在 YEPD 液体培养基(pH5~6)中的 MIC 为 16μg/mlg/ml。 3.2 培养基 pH 对 MIC 值的影响结果发现在沙氏培养基中,pH 为 3 时其 MIC 值为 32μg/mlg/ ml,pH 为 5 时其 MIC 值为 8μg/mlg/ml,pH 为 8 时在最高药物浓度的条件下白色念珠菌也能很好 的生长。 3.3 接种真菌浓度对 MIC 值的影响结果见表 1。表 1 接种真菌浓度对 MIC 值的影响结 果 4 讨论 培养基的种类及其 pH、接种真菌浓度对抗真菌药物在试管内的抗真菌活性影响很大 [2]。如氟康唑在低 pH 时活性可降低 10μg/ml0μg/ml0μg/ml 倍。甚至同一种培养基,由于 pH 不同,其抗菌活 性也不一样[3]。因此,国外在研究抗生素和化学合成药物的抗真菌活性时,对使用的培养基 种类及其 pH 非常重视,常选用不同的培养基和把同一种培养基调整成不同的 pH 进行研究。 国内绝大多数研究者只用沙氏培养基,对培养基的 pH 也没有进行调整,所以可能影响某些药 物的抗真菌效果。pH 的不同可能是药物在两种不同培养基中的 MIC 不同的原因之一。在 不同的实验中,实验条件不尽相同,需要接种与积累的菌量不同。所以需考察接种真菌菌液浓 度对药物敏感性的影响。如表 1 所见接种真菌量在 10μg/ml2、10μg/ml3、10μg/ml4、10μg/ml5、10μg/ml6cfu/ml 时,PLAB 对白色念珠菌的 MIC 分别为 2、4、8、8、32μg/mlg/ml。随着接种菌量的增加,最低抑 菌浓度也增加,这可能与药物需作用于真菌细胞的数量有关,接种菌量的大小直接影响抗真菌 药物的抗菌效果。在一般情况下,在一定范围内,接种的菌量越大,药物的抗菌效果往往就越 差。如很多研究者在做中药抗丝状真菌实验时,直接从菌种中取一小块菌块接种到含药培养 基中。这样,不同研究者取的菌块大小差别较大,甚至同一研究者在同一批实验中,在不同的 试管中接种的菌量也不一样,这就会影响中药抗真菌实验结果的准确性。这也可能是对同一 种药物,不同研究者所得的结果不一致的主要原因[4]。AmB 具有较强的抗白色念珠菌的作 用,其抗白色念珠菌的活性依赖于所选择的实验条件,体外 MIC 决定于培养基的种类、培养 基的 pH 值、接种菌量、血清的加入量、培养时间、氧气的含量等。在改良沙氏培养基的 MIC 低于在 YEPD 培养基中的 MIC;接种浓度增加,抑菌效果降低;抑菌活性有 pH 依赖性,在 低 pH 时,药物的 MIC 较低,在高 pH 时,药物的 MIC 显着升高。多年来,抗真菌药物敏感试验 方法不统一,与体内药效不完全一致,以致发展缓慢。美国国家临床实验室标准委员会的抗真 菌药物敏感性试验专门委员会于 1992 年公布了世界第一个试验标准 M27-P(NCCLS),酵母 菌液体培养基稀释法抗真菌药物敏感性实验的参考方法,用于规范药物敏感性实验的方法,以 使得所得的实验结果更加可信,更加有利于指导临床用药。 【摘要】【目的】探讨具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中药复方仙鱼汤对小鼠 Lewis 肺癌生长的抑制作用及其相关的分子机制。【方法】将 50μg/ml 只 Lewis 肺癌荷瘤小鼠分为仙鱼 汤高、中、低剂量组(剂量分别为 1.747、0μg/ml.874、0μg/ml.437g·kg-1·d-1),环磷酰胺(CTX)组(剂量 为 20μg/mlmg·kg-1·d-1),荷瘤模型组;计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率;制备单细胞悬液,采用 流式细胞仪检测各组小鼠 Lewis 肺癌细胞周期、细胞凋亡率;采用免疫组化法检测各组 Lewis 肺癌小鼠的 bcl22 基因的表达。【结果】仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组瘤体质 量均低于模型组,肿瘤细胞凋亡率均高于模型组(P<0μg/ml.0μg/ml5 或 P<0μg/ml.0μg/ml1),仙鱼汤各组随着药物剂 量的增大,抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组处于 S 期的细胞比例均低于模型组(P<0μg/ml.0μg/ml5 或 P<0μg/ml.0μg/ml1),呈现明显的 G0μg/ml/G1 期阻滞现象。仙鱼汤各 剂量组 bcl22 染色强度指数显着低于模型组(P<0μg/ml.0μg/ml1)。【结论】仙鱼汤具有抑制小鼠 Lewis 肺癌生长的作用,其机理可能与通过降低 bcl22 表达从而促进肿瘤细胞凋亡有关。 【关键词】仙鱼汤/药理学肺肿瘤/中药疗法细胞凋亡基因表达调控细胞培养 肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,中医药在肺癌的治疗中发挥着越来越重要的 作用。仙鱼汤是治疗肺癌的经验方,具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效,多年的临床应用已证实 其具有较好的临床疗效[1-2]。本研究通过动物实验,进一步研究了仙鱼汤对小鼠 Lewis 肺癌 生长的抑制作用,并从诱导肿瘤细胞凋亡及调控凋亡相关基因的角度探讨其作用机理。现报 道如下。 1 材料与方法 1.1 动物 C57BL/6J 小鼠,雌雄各半,体质量 18~22g,SPF 级,由广州中医药大学实验动物 中心提供(合格证号:0μg/ml0μg/ml20μg/ml535)。 1.2 瘤株小鼠 Lewis 肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供,广州中医药大学第一 附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。 1.3 药物与制备仙鱼汤组成:仙鹤草 15g,鱼腥草 30μg/mlg,猫爪草 30μg/mlg,山海螺 30μg/mlg,党参 15g, 三七片 10μg/mlg,山慈菇 10μg/mlg,浙贝母 15g,守宫 5g,天冬 15g,黄芪 30μg/mlg,炙甘草 5g。由广州中医药 大学新药研究中心制备,按照传统煎煮法煎煮,低、中、高剂量组药物浓度根据人与动物体表 面积与计量换算法计算[3],低剂量组 1.0μg/ml92g/mL,中剂量组 2.184g/mL,高剂量组 4.368g/mL, 分别相当于临床等效剂量的 1、2、4 倍。制备后于 4℃冰箱中贮存备用。环磷酰胺(CTX) 注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品(批号:20μg/ml0μg/ml60μg/ml20μg/ml6),20μg/ml0μg/mlmg/支,临用前用生理盐水 溶解,稀释浓度为 2mg/mL,根据 CTX 的半数致死量(LD50μg/ml)为 472mg/kg,注射用量为 LD50μg/ml 的 1/3~1/5,故小鼠给药剂量设为 20μg/mlmg·kg-1·d-1。 1.4 主要试剂与仪器碘化丙啶(PI)染液为晶美生物工程有限公司产品;bcl22 兔多克隆抗 体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色(SABC)试剂盒(SA10μg/ml22)均为博士德生物工程有 限公司产品;RPMI21640μg/ml 培养基为 Gibco 公司产品;二甲苯、乙醇,均为市售分析纯;超净工作 台(苏净集团安泰公司);冷冻桌面离心机(Eppendorf5810μg/mlRCentrifuge);解剖显微镜(北京电子 光学设备厂);37℃电热恒温水浴箱(上海恒丰仪器仪表有限公司);ALTRA 型流式细胞仪(美国 Beckmancoulter 公司);CS2Ⅳ 型烤片机(孝感市电子仪器厂);亿鸣220μg/ml0μg/ml 病理图像分析系统(中 国亿鸣)。 1.5Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型复制于液氮罐中取出 Lewis 肺癌细胞株 1 支,置于 37℃电 热恒温水浴箱内,轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管,用酒精消毒后开启,用吸管吸出细胞 悬液,注入离心管并滴加体积分数 10μg/ml%小牛血清 RPMI21640μg/ml 培养基,常规离心,制成瘤细胞混 悬液,台盼蓝计数约为 1×10μg/ml7/mL 瘤细胞。消毒小鼠右前腋,取 0μg/ml.2mL(约 1×10μg/ml6~2×10μg/ml6 个瘤 细胞)接种于皮下。传代 3 次。在无菌条件下剥离 Lewis 肺癌荷瘤鼠皮下瘤块,选取生长良好 的瘤组织,剪碎、称质量,用细胞匀浆器制成匀浆,按体积比 1:3 加生理盐水制成瘤细胞混悬 液,接种于 C57BL/6J 小鼠右前肢腋窝皮下,每只 0μg/ml.2mL(约 1×10μg/ml6~2×10μg/ml6 个瘤细胞)。 1.6 分组及给药接种 24h 后随机分为 5 组:仙鱼汤高剂量组(剂量为 1.747g/kg)、仙鱼汤 中剂量组(剂量为 0μg/ml.874g/kg)、仙鱼汤低剂量组(剂量为 0μg/ml.437g/kg)、CTX 阳性对照组(剂量 为 20μg/mlmg/kg)、荷瘤模型组。中药各组均予以 0μg/ml.4mL 中药灌胃,CTX 组予以 0μg/ml.2mL 腹腔注射, 荷瘤模型组予以 0μg/ml.4mL 生理盐水灌胃,均每日 1 次,给药 14d。 1.7 观察指标及检测方法 1.7.1 小鼠生活状态观察实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。 1.7.2 抑瘤率末次给药后 24h,Lewis 荷瘤小鼠颈椎脱臼处死,用眼科剪分离剥取肿瘤,电 子天平称质量,计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率[4]:p 抑瘤=(1-m 实验组/m 模型 组)×10μg/ml0μg/ml%。 1.7.3 细胞周期分析及细胞凋亡检测取小块瘤组织,加入生理盐水洗净血迹后倒掉,再加 入 1mL 生理盐水,用眼科剪剪碎组织,吸管轻轻吹打,过 30μg/ml0μg/ml 目筛,收集单细胞悬液于流式专用 管,加入 2mL 中性磷酸盐缓冲溶液(PBS),130μg/ml0μg/mlr/min 离心 5min 洗涤 2 次,调整细胞计数约 1×10μg/ml6/mL,加入体积分数 70μg/ml%冰乙醇 2mL 吹打后封口固定,保存于 4℃冰箱 24h。将固定的 单细胞悬液离心,去固定液,加入 PBS 重新悬浮,洗涤 2 次,30μg/ml0μg/ml 目筛网过滤 1 次,加入 1mLPI 染液(终浓度 10μg/ml0μg/mlmg/L),4℃避光染色 30μg/mlmin,流式细胞仪检测,收集 50μg/ml0μg/ml0μg/ml0μg/ml 个细胞,应用 multicycle 软件分析凋亡率[5]。 1.7.4 病理检查肿瘤组织经体积 分数 10μg/ml%福尔马林固定 24h 后常规石蜡包埋,4μg/mlm 厚连续切片,苏木素-伊红(HE)染色, 光镜观察肿瘤生长、肿瘤坏死、间质反应和肿瘤及肿瘤周围组织炎症细胞浸润情况并摄片。 1.7.5bcl22 阳性表达检测采用免疫组化法。常规石蜡包埋后,4μg/mlm 厚连续切片,行 SABC 法免疫组织化学染色,用 PBS 液代替一抗做阴性对照。光学显微镜下观察,bcl22 蛋白染色细 胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野(40μg/ml0μg/ml)下随机计数 5 个视野。计算出各组的染色强度指 数(stainingintensityindex,pSII)。pSII=(pA 强度瘤细胞×0μg/ml)+(pB 强度瘤细胞×1)+(pC 强度瘤 细胞×2)+(pD 强度瘤细胞×3)。其中 A 强度代表细胞浆无特异性染色;B 强度代表细胞浆呈 特异性浅棕黄色,染色较浅;C 强度代表细胞浆呈特异性棕黄色;D 强度代表细胞浆呈特异性 深棕色,染色较深。染色强度指数(pSII)的范围在 0μg/ml~3[6]。 1.8 统计学分析采用 SPSS11.5 统计软件处理。 2 结果 2.1 一般状况的观察实验结束后,模型组、CTX 组小鼠表现为身体瘦小,活动少,喜聚群, 毛发缺少光泽;CTX 组小鼠于实验 5~7d 开始出现脱毛,进食减少;仙鱼汤高、中、低剂量组 小鼠脱毛现象少于 CTX 组及模型组,活动力优于 CTX 组及模型组。 2.2 各组抑瘤率比较表 1 结果表明,仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组瘤体质量均低于 模型组(P<0μg/ml.0μg/ml5 或 P<0μg/ml.0μg/ml1)。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大,瘤体质量逐渐减轻,抑瘤率逐 渐增高。 表 1 各组 Lewis 肺癌小鼠的瘤体质量及抑瘤率比较(略) Table1Comparisonoftumormassweightandtumor2inhibitoryrateindifferentgroups 统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,P<0μg/ml.0μg/ml5,②P<0.01,P<0μg/ml.0μg/ml1,与模型组比较 2.3 各组细胞凋亡率及细胞周期分析仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组小鼠 Lewis 肺 癌细胞凋亡率均高于模型组(P<0μg/ml.0μg/ml5 或 P<0μg/ml.0μg/ml1),各仙鱼汤组随着剂量的增大,凋亡率亦逐渐 增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组处于 G0μg/ml/G1 期细胞的比例均高于模型组,其中仙 鱼汤高剂量组、CTX 组与模型组比较,差异有显着性意义(P<0μg/ml.0μg/ml1)。仙鱼汤高、中、低剂量 组及 CTX 组处于 S 期细胞的比例均显着性低于模型组(P<0μg/ml.0μg/ml5 或 P<0μg/ml.0μg/ml1),呈现明显的 G0μg/ml/ G1 期阻滞现象。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组处于 G2/M 期细胞的比例与模型组比 较,差异无显着性意义(P>0μg/ml.0μg/ml5)。结果见表 2、图 1。 2.4 光镜观察模型组癌细胞大小和形态很不一致,可见瘤巨细胞;癌细胞核体积增大,细胞 核和细胞浆比例增大,核的大小、形状、染色不一,可见巨核、多核,核染色深,核染色质呈粗 颗粒状,分布不均匀;核仁肥大,数目增多,核分裂相增多,可见不对称性、多极性及顿挫性等病 理性核分裂相,间质内淋巴细胞少见(图 2-a)。CTX 组可见大片坏死,间质见较多的淋巴细胞 等炎细胞浸润,纤维组织反应性增生(图 2-b)。仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增大,间 质可见淋巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体(图 2-c、d、e)。 2.5 各组 bcl22 染色强度指数凋亡相关基因 bcl22 的阳性产物主要位于细胞浆,可见大量 的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组 bcl22 的染色强度指数均显着低于模型组 (P<0μg/ml.0μg/ml1),并呈剂量依赖性,而 CTX 组与模型组比较差异无显着性意义(P>0μg/ml.0μg/ml5)。结果见表 3、图 3。 表 2 各组小鼠 Lewis 肺癌组织的细胞凋亡率及细胞周期分析(略) Table2Comparisonofcellapoptosisratioandcellcycleanalysisindifferentgroups 统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,P<0μg/ml.0μg/ml5,②P<0.01,P<0μg/ml.0μg/ml1,与模型组比较 a.模型组 b.CTX 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 1 各组凋亡率检测流式细胞图谱比较(略) Figure1Resultsofcellapoptosisratiodetectedbyflowcytometerindifferentgroups a.模型组 b.CTX 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 2 各组肿瘤组织形态比较(HE 染色,×40μg/ml0μg/ml)(略) Figure2Morphologicalchangesoftumorcellsunderlightmicroscopeindifferentgroups(HE staining,×40μg/ml0μg/ml) a.模型组 b.CTX 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组 图 3 各组 bcl22 阳性表达比较(免疫组化,×40μg/ml0μg/ml)(略) Figure3Positiveexpressionofbcl22indifferentgroupsdetectedbyimmunohistochemical method 表 3 各组 bcl22 染色强度指数比较(略) Table3Comparisonofstainingintensityindexofbcl22indifferentgroups