海藻硫酸多糖制备及抗凝血研究论文

摘要:海藻硫酸多糖是从海藻中提取的一类生物活性多糖,迄今已提取出多种具有抗凝血 活性的海藻硫酸多糖,它作为一种有望替代肝素的新型抗凝血活性物质日益受到关注。现就 目前国内外对海藻硫酸多糖的制备及其抗凝活性的研究进展作一综述。 关键词:海藻;硫酸多糖;抗凝血 中图分类号:R282.77 文献标识码:A 文章编号:1672-979X(2007)08-0054-03 海藻硫酸多糖(sulfatedpolysaccharideformseaweed,SPS)是从海藻中提取的多糖硫酸 化衍生物,是多糖分子链中单糖分子的部分羟基被硫酸根取代而形成的一类多功能活性物质, 由不同的单糖基通过糖苷键(一般为 C1,3-键和 C1,4-键)相连而成。SPS 的来源不同,其糖基 单体及硫酸基的位置也不相同。研究表明,SPS 具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂、降血糖、抗 凝血以及增强机体免疫机能等生物学活性,日益受到关注。目前常用的抗凝药物是从动物体 中获得的肝素,其来源有一定限制。SPS 抗凝血活性显着,来源广泛且无副作用,有望代替肝 素成为新型的抗凝血药物。临床资料表明,SPS 对缺血性心脑血管疾病及高血黏度综合征有 明显的抗凝、解痉、解聚、降压降脂、降低血液黏度以及扩张血管、改善微循环的作用。 1.SPS 的来源 1913 年 Killing 首次从褐藻中提取了具有抗凝血活性的 SPS,1957 年 Springer 等报道, 从墨角藻中分离到的褐藻多糖硫酸酯在体内和体外都表现出了强抗凝血活性。1958 年 Gerber 从胶质石花菜(Gelidiumcartiagenium)中提取了呈高度硫酸化的 SPS。在很长一段 时间内人们认为,具有抗凝血活性的硫酸多糖主要是从褐藻中提取的岩藻聚糖和从红藻中提 取的卡拉胶,绿藻中没有抗凝血硫酸多糖。直到 1985 年 Deacon 报道,绿藻 Codiumfragilessp.tomentosides 中有抗凝血活性多糖,人们才开始将目光转向绿藻,并从刚 毛藻、蕨藻、孔石莼等绿藻中发现了含量很高的硫酸多糖。表明硫酸多糖在海藻中普遍存 在,来源非常广泛。 2.SPS 的制备 SPS 制备的主要工艺环节包括破碎、浸提、沉淀、纯化、水解等。浸提及沉淀是影响 收率、产品质量及经济性的主要环节,纯化与水解则是关系到其生理活性的重要因素。 2.1 粗多糖的制备 目前制备粗多糖多用水提醇沉法。通常是用热水浸提破碎的海藻,离心得到上清液,浓缩 并加入 60%~75%乙醇沉淀多糖。离心后再用乙醚、丙酮、无水乙醇等反复洗涤,干燥即得 粗多糖。也可用微波、超声波以及反复冻融等方法辅助提取,以提高多糖的提取率并缩短提 取时间。此外,还可用稀酸、稀盐溶液提取或复合酶-热水浸提相结合的方法提取,但提取条 件不能过分强烈以免破坏其天然高级结构,或造成硫酸基团脱落而丧失生物活性。提取硫酸 多糖一般不用碱溶液,因为碱处理易使 SPS 的硫酸基团脱落,用稀酸提取则不存在这个问题。 吴永沛[1]报道,提取福建产海带岩藻聚糖的条件是用 8 倍 0.1mol/L 盐酸提取 2h,70%乙醇沉 淀精制,岩藻聚糖的提取率为 2.1%,产品 SO42-含量为 20%。工艺条件温和,不使用有害元 素或化学品,产品安全度高、生物活性强。酶法提取多用纤维素酶或果胶酶使细胞破壁以提 高收率,酶解法具有条件温和、杂质易除去等优点。 提取液含有褐藻胶时,可先用低浓度的乙醇沉淀褐藻胶,再用高浓度的乙醇沉淀硫酸多糖。 还可用氢氧化铅、氢氧化铝以及季胺盐类阳离子表面活性剂沉淀多糖。 2.2 硫酸多糖的纯化 沉淀所获得的多糖常含有较多的蛋白质,可选用 Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸 法或是蛋白酶水解法脱去蛋白质,得到多糖粗品。Sevag 法操作繁琐,多糖损失量大,且有有 机溶剂残留;三氯醋酸法反应剧烈,易使糖苷键断裂;蛋白酶法不仅脱蛋白效率高而反应条件 温和,多糖不易破坏或损失。文献[2]报道,用碱性蛋白酶脱除多糖中的蛋白质,脱除率可达 86.4%,多糖收率为 89.3%;Sevag 法的蛋白质脱除率虽然达 87.9%,但多糖收率仅为 28.6%。 进一步的分离纯化多采用色谱柱层析法,纯化硫酸多糖多用弱阴离子交换柱层析,如 DEAE-cellulose-52[3],DEAE-SepharoseFF[4]等。根据所带电荷的不同可用不同浓度的盐 溶液分离硫酸多糖,然后根据相对分子质量大小用葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶柱层析进一步分 离纯化。Yasantha[5]研究褐藻 Eckloniacava 硫酸多糖的抗凝血活性时,使用两次 DEAE-纤 维素层析柱得到单一的洗脱峰,再用 Sepharose4B 柱层析再次纯化,经琼脂糖凝胶电泳检测 为相对单一的组分。 2.3SPS 的水解 天然的 SPS 是一种含有多种单糖和硫酸基的水溶性杂多糖,其相对分子质量从几万至 几十万不等,结构复杂,难吸收。用适当的方法降低海藻硫酸多糖的相对分子质量,是亟待解 决的问题。降解 SPS 可用酸解法、碱解法、盐解法、酶解法、超声波降解和射线降解,但 这些方法对多糖的降解大都是随机的,所得降解产物相对分子质量范围较大;专一性的糖苷酶 因价格昂贵不适合大规模工业生产。王琪琳等[6]用自由基方法降解海带硫酸多糖,可使多糖 的相对分子质量降低到 1 万左右,不但相对分子质量很集中,而且降解之后海带硫酸多糖的多 糖含量、硫酸根含量均增加,而单糖组成及多糖结构基本没有变化;Elisa[7]用 H2O2 降解 Schizymeniabinderi 中的硫酸多糖,得到相对分子质量约 8.5×103 的片断,且具有抗凝血活性; 马夏军[8]用超声波辅助 H2O2 降解麒麟菜硫酸多糖,降解后不需处理氧化剂,相对分子质量 为 5×103~4×104,水溶性明显增强,且活性基团得以较好地保留。 3.SPS 多糖抗凝血作用机制 SPS 抗凝血的机制与肝素类似,它能提高抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ))的活性,抑制凝血过程中必需 的丝氨酸蛋白酶、凝血酶和活化因子(FXa)的活性。Church[9]的研究表明,岩藻聚糖浓度为 10μg/mLg/mL 时可激活肝素辅助因子Ⅱ(HCⅡ),),使 HCⅡ), 介导的抗凝血酶活性提高超过 3500 倍,而 对的 ATⅢ) 介导凝血酶的活化因子无太大影响,表明岩藻聚糖主要通过增强 HCⅡ), 发挥了抗凝 血的作用;Takashi[10]认为,昆布硫酸多糖能显着抑制内源性途径和外源性途径凝血酶的产 生,它主要是抑制凝血酶的产生过程,而不是抑制凝血酶的活性。此外,还有研究表明,低相对 分子质量岩藻糖可加强 ATⅢ) 和 HCⅡ), 对凝血酶的抑制作用[11];从绿藻 Codiumcylindricum 中 提取的硫酸半乳糖体虽没有增强 ATⅢ) 和 HCⅡ), 的活性,但可以直接抑制凝血酶活性以及血纤 维蛋白的聚合[12]。 4.影响 SPS 抗凝血活性的主要因素 影响 SPS 抗凝血活性的因素很多。不同来源的硫酸多糖抗凝血的活性会有很大差别。 Yasantha[5]比较了 7 种褐藻硫酸多糖的抗凝血活性,发现 E.cava,S.horneri 以及 S.coreanum 的抗凝血活性最强,其它 4 种褐藻的抗凝血活性则较弱;Maria[13]研究了红藻 Gelidiumcrinale.硫酸多糖的结构与抗凝血活性的关系,发现 2,3-二硫-α-半乳糖单元可增强 抗凝血作用;Yasantha[5]测定了褐藻硫酸多糖酶解后多糖片断的 APTT、TT 和 PT 活性,结 果表明,相对分子质量大于 3×104 的片断表现出高抗凝血活性;Shanmugam 等[14]的研究表 明,相对分子质量为(0.05~1)×104 的岩藻聚糖有抗凝血活性,相对分子质量大于 8.5×104 的 片断则没有抗凝血活性;Susanne 等[15]研究表明,硫酸多糖抗凝血活性与相对分子质量呈哑 铃型曲线关系;Mariana[16]指出,呈线性结构的硫酸半乳糖体的抗凝血活性依赖于所带的电 荷量、单糖的组分、硫酸基和糖苷键的位置等;Groth 等[17]比较相同取代条件下硫酸化纤 维素和磷酸化纤维素的抗凝血活性,发现后者的最低抗凝血浓度为 2~5mg/mL,是前者的 100 倍;若以四元胺基取代硫酸化纤维素中的硫酸基,则其原有的抗凝血活性全部消失。表明虽然 同为负电荷的取代基,其产生生物学活性的效果不同,硫酸根更能诱导抗凝血活性;Mulloy 等 [18]通过核磁共振分析发现,保持硫酸基取代度不变,将硫酸软骨素 BC4 位上的硫酸基变为 C6 位硫酸基,其抗凝血活性完全丧失,表明 C4 位上的硫酸基发挥着抗凝血作用;王静凤等 [19]的研究表明,枝管藻多糖普遍具有抗凝血作用,且有明显的量-效依赖关系;施志仪[20]指出, 褐藻糖胶有明显的抗凝血作用,且静脉注射的效果明显好于腹腔注射。由此可见,影响 SPS 抗凝血活性的因素主要有硫酸多糖的来源、结构、相对分子质量大小、糖苷键的连接形式、 单糖组成、硫酸基的含量与位置以及硫酸多糖的用量与摄入方式等。 5.应用开发前景 全世界的藻类约 3 万余种,迄今被人们广泛利用的主要是红藻、绿藻和褐藻 3 大类,约 100 余种。大量研究表明,SPS 具有抗凝血活性,它具有抗血栓形成和溶解血栓的双重作用, 在溶栓的同时能防止新的血栓形成,这是目前临床应用的抗凝血剂和溶栓剂都不具备的特点, 所以,SPS 有望取代肝素成为抗凝血药物的新来源。中国海洋大学药物所已经利用褐藻胶研 制出多糖硫酸酯(PSS)、甘糖酯(PGMS)等治疗心脑血管疾病的药物。我国有丰富的海藻资 源,在开发具有抗凝血活性的 SPS 方面有着广阔的发展前景。