蛋白质质谱分析管理论文

摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述 了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用， 并对其发展前景作出展望。 关键词：蛋白质，质谱分析，应用 前言： 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占 细胞干质量的 50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、 调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质 也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家 极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立 体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断 成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)JohnB.Fenn)和田中耕一(JohnB.Fenn)Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和 结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅 速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它 的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法 已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研 究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克 级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定， 同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电 喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱； 5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广 泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为 基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级] 结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数 目和位置。 3.1 蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(JohnB.Fenn)ＭＳ)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质 辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。 其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场 将具有特定质量与电荷比值(JohnB.Fenn)Ｍ/Ｚ值值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的 离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值值，分析鉴定未知蛋白质。 3.2 蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效 的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序 列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括Ｎ末端序列测定的化学末端序列测定的化学 方法 Edman 法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端酶解方法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例 如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的Ｎ末端序列测定的化学末端氨基酸苯异硫氰酸酯 (JohnB.Fenn)phenylisothiocyanate)PITC 分析法(JohnB.Fenn)即 Edman 法，又称 PTH 法)，测序速度较慢(JohnB.Fenn)50 个氨 基酸残基/天)；样品用量较大(JohnB.Fenn)nmol 级或几十 pmol 级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨 基酸残基往往会错误识别，而对Ｎ末端序列测定的化学末端保护的肽链则无法测序[4]。Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例末端化学降解测序法 则由于无法找到 PITC 这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下， 质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛 注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋 白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱 (JohnB.Fenn)electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(JohnB.Fenn)matrixassistedlaserdesorption/ ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测 限下降到 fmol 级别，可测定分子量范围则高达 100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离 飞行时间质谱法(JohnB.Fenn)MALDITOFMS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级 结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键 技术之一[5]。目前在欧洲分子生物实验室(JohnB.Fenn)EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了 MALDITOFMS 蛋白质一级结构(JohnB.Fenn)序列)谱库，能为解析 FAST 谱图提供极大的帮助，并为确 证分析结果提供可靠的依据[6]。 3.3 蛋白质的质谱分析方式 质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱 (JohnB.Fenn)proteinmapping))，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质 谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白， 从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测 分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应 的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与 Edman 法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从Ｎ末端序列测定的化学端或Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例端逐一降解下氨基酸残 基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(JohnB.Fenn)laddersequencing))，经质谱 检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。 3.3.1 蛋白消化 蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成 小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20 个氨基酸的多肽最适合质谱仪 的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(JohnB.Fenn)trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(JohnB.Fenn)lysine)和精氨酸 (JohnB.Fenn)arg)inine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。 3.3.2 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(JohnB.Fenn)MALDI-TOFMS)[7] 简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号， 并依据质量/电荷之比(JohnB.Fenn)mass/charg)e，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个 蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(JohnB.Fenn)matrix)混合，此样品混合物 随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格 状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(JohnB.Fenn)lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学 基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。 由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入 飞行时间质量分析仪(JohnB.Fenn)TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析 仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成 反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量 /电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较， 以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(JohnB.Fenn)peptidemassfin-g)erprinting))。基 质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便，敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹 配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的 首选蛋白质谱鉴定方法。 3.3.3 电子喷雾电离质谱测量法(JohnB.Fenn)electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8] 同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱 测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体 多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这 些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连 续质量分析仪(JohnB.Fenn)tan-demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多 肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电 荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(JohnB.Fenn)ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子 谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的 蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也 可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。 4．蛋白质质谱分析的应用 1981 年首先采用 FAB 双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(JohnB.Fenn)Ｍｒ=1318)，质谱中出 现准分子离子[Ｍ+1]+=1319 强峰。分子量小于 6kDa 肽或小蛋白质合适用 FAB 质谱分析， 更大分子量的多肽和蛋自质可用 MALDI 质谱或 ESI 质谱分析。用 MALDI-TOF 质谱分析蛋 自质最早一例是 HillenKramp 等[9]于 1988 年提出用紫外激光以烟酸为基质在ＴＯＦ谱仪谱仪 上测出质量数高达 60kDa 蛋白质，精确度开始只有 0.5%，后改进到 0.1-0.2%。质谱技术 主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质 量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11],三条肽段的精确质 量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、 检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(JohnB.Fenn)如:SEQUEST)SEQUEST)的应用使 得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用 2D 电泳及ＭＳ技术对整个 酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出 1484 种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的 蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研 究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(JohnB.Fenn)SDNP)的分子结构[15]等。 结束语： 在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(JohnB.Fenn)accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱 测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、 用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍 生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质 谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一 钙拮抗剂具有抑制 Ca2+内流的作用，改变心肌，平滑肌的兴奋---收缩偶联过程，松 弛血管平滑肌，减轻后负荷，降低血压。自七十年代钙拮抗剂作为血管扩张药物应用以来， 被广泛应用于高血压和冠心病治疗。临床应用钙拮抗剂一般治疗量，患者常能耐受。其常 见不良反应有外周水肿、便秘、头晕、面部潮红、头痛、皮疹及心悸等。以常用四种钙拮 抗剂为例，其不良反应发生情况如下表：维拉帕米硫氮卓酮硝苯啶非洛地平 踝部水肿+++++++++ 便秘+++++00 头晕+++++或+++ 面部潮红+++++++ 头痛++++++ 心悸或心动过速 00+++ 皮疹++00 1.外周水肿：见于各类钙拮抗剂，以二氢吡啶类发生率最高。常见于踝部，但亦可发 生于手部。常静坐工作的病人容易发生外周水肿，晚间尤为明显。外周水肿与钙拮抗剂扩 张血管作用有关。血管扩张致使组织毛细血管压力增高，从而加速血管内液体滤出、组织 间液增加，导致外周水肿。 2.便秘：常见于苯烷胺类钙拮抗剂如维拉帕米、甲氧维拉帕米，亦可见于硫氮卓酮。 其发生程度与所用剂量成正相关，剂量越大，发生程度亦重。在连续长期使用过程可逐渐 减轻。 3.头痛与面部红肿：亦与血管扩张有关，一般均可耐受。在长期用药过程中，经血管 自动调节机制，可逐渐消失。 4.心动过速或心悸：常见于二氢吡啶类钙拮抗剂，系血管扩张所致的反射性心博加速 的临床表现。临床应用较大剂量时易于发生。与 b 受体阻滞剂合用能控制该类不良反应。 另外，大量应用钙拮抗剂，尤其经静脉途径给药时，其固有的负性频率作用，负性传导作 用及负性肌力作用可引起心率减慢、房室传导延缓。血管外周阻力的过度降低还可导致低 血压反应。 近年在临床使用过程中还发现，某些钙拮抗剂如维拉帕米 Verapamil、硝苯吡啶 Nifedipine 和地尔硫卓 Diltazem 短期或长期治疗可能使血液动力学及临床预后恶化。鉴于 此，本文将钙拮抗剂在心血管疾病中的不良反应做一概述，以期引起临床使用中的注意。 1.治疗心力衰竭 钙拮抗剂能扩张全身”碎裂及外界作用诱导碎裂阻力血管，减轻后负荷，阻滞 Ca2+内流入心肌细胞，减少细胞 内钙负荷过重，保护已处于缺血状态的心肌。从该理论出发，钙拮抗剂在心力衰竭中治疗 应是安全有效的。但 Elkayam[1]等做随机、双盲、交叉的前瞻性研究，比较单用硝苯吡啶 或与二硝酸异山梨醇酯（ISDN)合用或单用 ISDN 治疗慢性充血性心力衰竭的效果和安全性， 结果提示用 ISDN 治疗相对稳定的心衰病人加用硝苯吡啶后心衰明显加重，38%病例需增 加利尿剂量，32%病例因心衰加重提前中止研究。Packer[2]等研究硝苯吡啶 20mg) 对左心 功能不全的血液动力学效应，结果有 55.2%(JohnB.Fenn)16 人)血液动力学恶化，左右心室每博指数下 降，平均右心房压升高，1 年生存率仅为 23%，而心衰未恶化的 13 人 1 年生存率为 67% (JohnB.Fenn)P<0.05)，提示硝苯吡啶加重病人心衰程度。 不仅硝苯吡啶有此类报道，据 Diltazem 多中心的梗死后试验的亚群分析[3]显示，在心 室射血分数〈0.40 病人中，297 例病人 21%出现晚期充血性心力衰竭，安慰剂组 326 例仅 12%(JohnB.Fenn)P<0.01)。研究结果提示地尔硫卓能加重原有充血性心力衰竭程度，其恶化的危险率 与心室射血分数密切相关。另据 MDPIT[4]试验，对心脏 X 影像显示有肺淤血的亚组病人进 行分析，结果发现地尔硫卓治疗病人心衰有加重趋势，心脏病死率明显增加。 钙拮抗剂加重充血性心力衰竭的作用机制是什么?目前认为[5]主要是由于钙拮抗剂的 负性肌力作用。其长期使用抑制心肌，使本已降低的心脏收缩功能进一步下降，血液动力 学恶化。另外钙拮抗剂可增加血浆去甲肾上腺素和肾素的活性，激活内源性神经激素系统， 尤其是肾素 ¾ 血管紧张素系统，引起血管紧张素 II 水平升高，产生缩血管反应和水钠潴留。 这亦是造成心衰加重的重要因素。确切机制目前有待于进一步研究。 临床研究已表明第一代短效钙拮抗剂在心衰病人中应用常引起心衰加重，预后不佳， 建议临床治疗充血性心力衰竭病人时应慎用该类药物。 2.治疗心绞痛 钙拮抗剂能抑制心肌兴奋时 Ca2+内流，降低心肌收缩力，提高心肌对缺血的耐受性， 并扩张血管，增加冠脉血流量，降低动脉血压，减轻心脏后负荷，广泛用于抗心绞痛。但 近年有研究表明，钙拮抗剂引起的冠脉扩张只对明显由冠脉痉挛所致心绞痛(JohnB.Fenn)如变异型心绞 痛，非心率相关的隐匿性心绞痛以及过度通气和部份寒冷诱发的心绞痛)特别有效，若用于 其他类型心绞痛治疗则无效甚至有害。 Eg)strup[6]报道硝苯吡啶虽能增加正常心肌灌注区血供，但不能改变甚至减少冠脉侧 支循环供给区血流，具潜在的促局部供血作用，在稳定型心绞痛病人中，凡冠状侧支循环 血流较好的病人，此作用明显，常使心绞痛症状加重。 Muller[7]在一早期研究中就指出，硝苯吡啶在控制不稳定型心绞痛方面比长效硝酸酯 及普萘洛尔疗效差。根据 HoblandInteruiversityNifedipine/MetoprololTrial（HINT）研究，研究， 用硝苯吡啶或美托洛尔及合用两药或用安慰剂对不稳定型心绞痛进行心肌缺血试验，结果 表明硝苯吡啶只对已接受 b 阻滞剂治疗的不稳定型心绞痛患者有效，对于未给 b 阻滞剂治 疗患者，硝苯吡啶与美托洛尔联合用药不比美托洛尔单独治疗好。可见，b 阻滞剂是治疗 不稳定型心绞痛的首选方案。但对于不能耐受 b 阻滞剂患者（尤其是合并呼吸道哮喘患 者）研究，可选择使用钙拮抗剂。另外在 b 阻滞剂基础上联合运用钙拮抗剂可减少副作用发生， 对单独使用 b 阻滞剂无效患者加用硝苯吡啶可能改善症状。目前在已使用 b 阻滞剂基础上 联合使用钙拮抗剂或维拉帕米等非二氢吡啶类钙拮抗剂用于早期不稳定型心绞痛治疗乃为 较佳选择。