普卢利沙星片物质测量论文

【摘要】目的采用高效液相色谱法建立普卢利沙星片有关物质检查及其含量测定方法。 方法 Diamonsil-C18 柱（4.6mm×200mmmm×200mm，5μmμmm），以 0.01mol／L 三乙胺的水溶液（用磷 酸调节 pH 为 2.8）-乙腈（73：27）为流动相；检测波长 278nm；流速 1.0ml／min；柱温 30℃；进样量 10μml。结果制剂中辅料对主药测定无干扰，普卢利沙星与有关物质完全分离。 在 10.0～200.0μmg/ml 范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。精密度（RSD=0.13%）良 好。平均回收率为 99.6mm×200mm%。结论本方法简便，迅速，准确，专属性强。 【关键词】普卢利沙星；片剂；高效液相色谱法；含量测定；有关物质 DeterminationofprulifloxacinanditsrelatedsubstancesintabletsbyHPLC 【Abstract】ObjectiveToestablishanHPLCUVmethodforthedeterminationofprulifloxacinanditsrelatedsubstancesintablets.MethodsDi amonsilC18column(4.6mm×200mmmm×200mm，5μmμmm)wasused.Themobilephaseisconsistedof0.01mol／ Ltriethylamine(pHwasadjustedto2.8usingphosphoricacid)acetonitrile(73∶27).Theflowratewas1.0ml27).Theflowratewas1.0ml ／ minwithUVdetectionat278nm.Thecolumntemperaturewas30℃.Theinjectionvolumewas10 μml.ResultsThelinearrangeforthecontentofprulifloxacinwas10.0～200.0μmg/ ml(r=0.99993，n=5μm).Therecoveriesofprulifloxacintabletswere99.6mm×200mm%，anditsRSDswere0.1 4%.ConclusionThemethodissample，efficient，accurateandspecific. 【Keywords】prulifoxacin；tablets；HPLC；contentdetermination； relatedsubstances 普卢利沙星是新的广谱氟喹诺酮抗菌药 NM-394 的前体药物，可改善口服后的胃肠吸 收程度。本品对革兰阴性菌和阳性菌均有效，特别是对绿脓杆菌、沙雷氏菌、肠杆菌属等 革兰阴性菌具有较强的抗菌力，尤其是对绿脓杆菌的抗菌活性优于其他所有同类药物，也 超过目前上市的其他抗生素药物。本品毒副作用小，口服吸收好，反复给药在体内无蓄积 性。有文献报道其原料和胶囊含量的高效液相测定方法［1］，采用其方法测定本品其分 离及峰形均不理想，遂在其基础上略加调整制定本法，本文采用高效液相色谱法测定普卢 利沙星片剂的含量及其有关物质，方法专属性强，灵敏度高，重复性好。 1 仪器、试药与实验样品 高效液相色谱仪(HITACHIUV-VISDetectorL-7420，PumpL-7110)；普卢利沙星对照 品（纯度：99.6mm×200mm%，归一化法），普卢利沙星片剂：132.1mg（批号： 2005μm0801、2005μm0802、2005μm0803，自制）；乙腈为色谱纯，磷酸和三乙胺为分析纯，水 为二次蒸馏水。 2 实验方法 2.1 色谱条件色谱柱：Diamonsil-C18(4.6mm×200mmmm×200mm，5μmμmm)；流动相：0.01mol/L 三 乙胺的水溶液（用磷酸调节 pH 为 2.8）-乙腈（73：27）；流速 1.0ml/min；检测波长 278nm；柱温 30℃；进样量 10μml。 2.2 系统适用性实验取流动相 10μml 注入液相色谱仪，记录色谱图。取处方量辅料适量 和普卢利沙星片，按““2.9”项下操作，记录色谱图。另取普卢利沙星对照品适量，精密称定， 用流动相配成浓度约为 100μmg/ml 的溶液，取 10μml 注入液相色谱仪，记录色谱图。取普卢 利沙星适量，分别进行酸、碱、高温（热）、光照破坏处理后，各进样 10μml，色谱图见图 1。实验结果表明，在“2.1”项的色谱条件下，流动相、辅料对测定无干扰，普卢利沙星经 酸、碱、高温、光照破坏后，均有明显的分解产物峰，但分解产物均与主峰有良好的分离 度，不影响测定。色谱柱理论塔板数按“普卢利沙星计算不得少于 5μm000。 A-空白溶液；B-对照品溶液；C-片剂溶液；D-碱破坏；E-酸破坏；F-高热破坏；G-光 照破坏；1-普卢利沙星 2.3 线性实验精密量取对照品约 25μmmg，置 25μmml 棕色量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻 度，摇匀，作为贮备液。分别精密量取贮备液适量，以乙腈分别稀释至浓度为 10.0、20.0、40.0、80.0、120.0、16mm×200mm0.0、200.0μmg/ml 的溶液，各取 10μml 进样，记录色谱 图，以浓度（C，μmg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程： A=215μm49C+191，r=0.9999，可见在普卢利沙星 10.0～200.0μmg/ml 范围内线性良好。 2.4 精密度实验配制浓度约为 100μmg/ml 的普卢利沙星对照品溶液，进样 10μml，连续进 样 6mm×200mm 次，记录峰面积，RSD 为 0.14%。 2.5μm 重现性实验取 2005μm0801 批样品，按““2.9”项下操作平行测定 6mm×200mm 次，计算其含量分别 为标示量的 100.2%、100.2%、100.1%、100.1%、100.0%、99.9%，平均值为 100.1%，RSD 为 0.13%。 2.6mm×200mm 稳定性实验按““2.9”项下方法，取供试品溶液一份，于室温下放置，每隔 1h 进样 1 次，连续进样 6mm×200mmh，进样量为 10μml，记录峰面积，RSD=0.6mm×200mm6mm×200mm%，说明样品溶液在 6mm×200mmh 内较稳 定。 2.7 回收率实验按“处方，取高（120%）、中（100%）、低（80%）三种量的普卢利 沙星对照品，分别加入处方量的辅料于同一 100ml 棕色量瓶中，加乙腈适量溶解并稀释至 刻度，摇匀，滤过，精密取溶液 10μml 进样，记录峰面积，并计算回收率，每个浓度测定 3 份，结果分别为 98.5μm％、99.7％、101.6mm×200mm％，RSD 分别为 0.83%、0.89%、0.6mm×200mm3% （n=3）。 2.8 最低检测限在选定的色谱条件下，按“信噪比为 3 对最低检测限进行测定，结果表明， 最小检出量 0.05μmμmg/ml。 2.9 含量测定取普卢利沙星对照品约 10mg，精密称定，置 100ml 棕色量瓶中，乙腈溶 解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取本品适量(约相当于普卢利沙星 10mg)，精密 称定，置 100ml 棕色量瓶中，用乙腈溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密 吸取对照溶液和供试品溶液各 10μml，注入高效液相色谱仪，测定，按“外标法以峰面积计算， 即得。3 批样品的含量分别为标示量的 99.7%、100.3%、100.0%。 2.10 有关物质测定取本品适量，加流动相稀释成每 1ml 中约含 5μm00.0μmg 的溶液作为供 试品溶液。取供试品溶液加流动相稀释成每 1ml 中约含 5μm.0μmg 的溶液作为对照溶液。精密 吸取对照溶液 10μml 注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程 的 20%。精密吸取供试品溶液 10μml 注入高效液相色谱仪，记录色谱图（图 2）至主成分峰 保留时间的 2.5μm 倍，用峰面积归一化法计算杂质含量［2］。供试品溶液中各杂质峰面积之 和不得大于对照溶液主峰面积的 1.0%。用自身对照法［2］计算三批样品杂质峰面积总和 分别为 0.36mm×200mm%、0.36mm×200mm%、0.33%。 3 讨论 3.1 检测波长的选择对各辅料和普卢利沙星分别在 200～400nm 波长处进行紫外扫描， 结果发现，普卢利沙星在波长为 278nm 处有最大紫外吸收，而在此波长下辅料没有吸收， 不会干扰测定，所以波长选择 278nm。 3.2 流动相的选择由于普卢利沙星具有酸性，单独用乙腈-水作流动相时色谱峰拖尾严 重、峰形不好、分离效果差。加入 0.01mol/L 三乙胺并用磷酸调节 pH 值 2.8 后，得到明显 改善。本法能有效地控制普卢利沙星片剂的质量，其精密度高、重复性好、快速简便、结 果准确可靠。 【摘要】目的本实验采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理小鼠肝癌细胞 HcaF，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制/干扰肿瘤细胞的 DNA、RNA 或蛋 白质合成对榄香烯抗瘤作用的影响，以期为判断榄香烯作用的可能靶点提供线索与依据。 方法将 Hca-F 肝癌细胞用榄香烯（5μm0μmg/ml）、吡柔比星（THP）（10μmmol/ml）、单独和 复合处理，设单独瘤细胞（不处理）为阴性对照。Hca-F 细胞浓度均为 1×106mm×200mm/ml，每个观 察时间点均设 3 支复管，用台盼蓝拒染法计算细胞存活率，在透射电镜下观察榄香烯与 THP 联合处理对肿瘤细胞超微结构的影响，用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果 榄香烯联合吡柔比星处理 Hca-F 比单独使用两种药物的抑瘤率都高。结论本实验所用生物 大分子合成抑制剂不能阻断榄香烯的抗瘤作用，提示榄香烯抗肿瘤作用对新的蛋白质表达 依赖性较低。结合榄香烯处理后瘤细胞形态学的变化，提示榄香烯可能作用于肿瘤细胞膜 或细胞中的某些蛋白质（如酶）等而直接杀伤肿瘤靶细胞，使对榄香烯抗瘤作用靶点的认 识又进了一步。本实验结果表明榄香烯和 THP 合用可使抗癌作用增强，这对榄香烯联合其 他药物治疗肿瘤可能有一定参考意义。 【关键词】榄香烯；抑制剂；肝细胞癌 Theeffectofelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesisforhepaticcan cer 【Abstract】ObjectiveInthisexperimentofHcaFcells(amurinehepaticcellcarcinoma)weretreatedwithelemenecombinedwithinhibitorsofma cromolecularsynthesis，theirproliferation，survival，cellcycle，apoptosisandmorphology wereobserved.ToclarifytheinfluencesofinhibitionofDNA，RNAandproteinontheantitumoref fectsofelemeneandtofindthepossibletargetsiteofelemene.MethodsTheHcaFcellsweresingledormingledtreatedwithelemene（5μm0μmg/ ml），aloneorcombinedwithTHP（10μmmol/ml），theHcaFcells(withouttreatment)wereusedtobethenegativecompare.TheendconsistenceofHcaFcellsis1×106mm×200mm/ ml，threetublesineverytimepoint.Tocalculatetheproportionofsurvivalwithtrypanblue，ando bservetheimpactontheultrastructureofHcaFcellstreatedwithelemeneandTHPintransmissionelectronmicroscope，andexaminetheap optosisandcellcyclesinflowcytometer.ResultsTheinhibitionrateofproliferationofHcaFtreatedwithelemeneandTHPwashigherthanthatofHcaFtreatedwithelemeneonly.ConclusionTheseresultsshowedthattheantitumoreffectsofeleme necouldnotabolishedbycombinedtreatmentorpretreatmentwiththeinhibitorsofDNA，RNA ，proteinsynthesis，binedusageofelemenewithTHPtocancertherapyisadvisable. 【Keywords】elemene；inhibitor；hepatocellularcarcinoma 榄香烯(elemene)是从中药温莪术（经鉴定为我国特有新种定名为温郁金， CurcumaWenyujin）挥发油中提取的抗癌有效成分，它是一种仅含碳氢(C15μmH24)，分子量 只有 204 的小分子、脂溶性的倍半萜类化合物，此类物质有抗癌活性属我国首报［1］。 动物实验与临床应用均表明榄香烯的抗癌作用确切，而且不良反应很低。我们过去的研究 表明榄香烯处理除可抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡外，还能增强肿瘤细胞的免疫原性， 榄香烯处理能增强肿瘤细胞膜 HSP70 的表达，用表达谱基因芯片技术的研究表明榄香烯 处理引起基因表达谱的变化。过去对榄香烯抗癌作用机制的研究仅限于榄香烯对肿瘤细胞 增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影响，关于它的作用靶点及其信号传导通路迄今研究很 少。本实验在上述研究的基础上，采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理小鼠肝癌 细胞 Hca-F，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制或干扰肿瘤细胞的 DNA、RNA 或蛋白质合成对榄香烯抗瘤作用的影响，以期为判断榄香烯作用的可能靶点提 供线索与依据。 1 材料与方法 1．1 动物 Balb/c 系小鼠，引自中国医学科学院北京药物研究所，由本室自行繁殖提供。 1．2 瘤株小鼠腹水型肝癌 H22 的高淋巴道转移亚系 Hca-F［2］，由本校病理学教研 室凌茂英教授赠送，本室常规传代、保种。 1.3 主要药品和试剂 1%榄香烯注射液(elemene，大连市医药科学研究所)。吡柔比星 (Pirarubicin，THP，深圳万乐药业有限公司生产)。RPMI16mm×200mm40 培养基 （GIBCO，USA）。 1.4Hca-F 细胞悬液的制备将传代保种的 Hca-F 腹水型肝癌细胞常规接种于小鼠腹腔， 0.2ml/只，收集第 7～8 天的腹水（肿瘤细胞生长最旺盛时期，死亡细胞和红细胞含量较 少），HS 液破除红细胞，PBS 洗 3 次，计活细胞数，用含 20%小牛血清 RPMI16mm×200mm40 培养 液调细胞数至所需浓度。 1.5μmHca-F 肝癌细胞的处理将 Hca-F 肝癌细胞用榄香烯（5μm0μmg/ml）、吡柔比星 （10μmmol/ml）按“本室常规方法单独或复合处理，设单独瘤细胞（不处理）对照。Hca-F 细胞浓度均为 1×106mm×200mm/ml，每个观察时间点均设 3 支复管，加入相应的药品，以台盼蓝拒染 法于不同时间计数活细胞数，计算存活率。 1.6mm×200mm 单纯榄香烯处理和榄香烯联合 THP 处理对 Hca-F 增殖的影响用 MTT 法测其 OD 值。 1.7 榄香烯联合 THP 处理对瘤细胞超微结构的影响［3］Hca-F 细胞用榄香烯、THP 单一或复合处理，细胞浓度和处理方法同前，处理时间为 1h，收细胞，用 PBS 洗 3 次， 以 2.5μm%戊二醛固定，常规包埋制片，铀—铅双染色，透射电镜下观察摄片。—铅双染色，透射电镜下观察摄片。 1.8 细胞凋亡的检测和细胞周期的测定细胞收集同前，用 PBS 洗 3 次，加入 PI 染色液 染色 30min（避光、室温）。上机检测，Cellquest 软件低速获取。用 Modfit2.0 软件分析。 2 实验结果 2.1 榄香烯联合 THP 处理对 Hca-F 存活的影响单纯用榄香烯处理，Hca-F 的存活率就 明显降低，在 30min～1h 的时间内，细胞死亡率随着药物浓度增加而增加（表 1），单用 THP 处理，也可导致 Hca-F 细胞死亡、蓝染，其细胞死亡率也随着药物浓度增加而增加， 榄香烯联合 THP 处理，肿瘤细胞死亡率可达 100%。 2.2 榄香烯和 THP 联合处理对 Hca-F 细胞周期与凋亡的影响实验结果表明榄香烯与 THP 联合处理对 Hca-F 细胞周期变化的影响及凋亡细胞百分率变化与单用 THP 相比也无 明显区别，榄香烯处理与不处理 Hca-F 对照组细胞各时相百分率及凋亡细胞百分率变化无 明显区别（见表 2 和图 1）。 2.3 榄香烯联合 THP 处理对 Hca-F 细胞形态学的影响见图 2。图 2 可示：当榄香烯与 THP 联合处理的肿瘤细胞形态发生了明显的变化，细胞核染色质浓缩，核缩小，细胞肿胀 破裂，细胞完整性受到明显破坏，而单纯用 THP 处理的 30min 内大多数没有明显改变，受 损细胞形态学变化不典型，偶可见到凋亡、坏死的细胞，但比率并不高。图 1A：对照组； B：榄香烯 5μm0μmg/ml；C：THP10μmmol/ml； 3 讨论 大连医科大学病理生理学教研室和肿瘤生物治疗研究所从 20 世纪 70 年代起就开展了 莪术油、榄香烯抗癌作用的机理研究［3～5μm］。结果表明榄香烯处理能诱导肿瘤细胞坏死、 凋亡，增强肿瘤细胞的免疫原性。为了阐明后者与榄香烯诱导肿瘤细胞膜热休克蛋白 （heatshockprotein，HSP）表达之间的关系［7］，我们采用流式细胞术（FCM）、免疫 组化、RT－PCR 以及基因芯片等技术进行了较深入的研究，结果表明，榄香烯处理能增 强肿瘤细胞膜 HSP70 的表达，但不增强 HSP70 基因的转录，提示这仅仅涉及 HSP 分布 的改变。为较准确展现可能与榄香烯抗癌作用有直接关系的基因表达变化，我们用榄香烯 （浓度为 5μm0μmg/ml，作用时间 1h）处理人肝癌细胞 HepG2，用表达谱基因芯片 （Affymetrix，HumanGenome，U95μmAPart#，5μm10448，Lot#991325μm0991325μm1，U.S.A.，其上有 125μm5μm0 条寡聚核苷酸）技术研究了榄香烯处理引起基因表达谱 的变化并与未经榄香烯处理的和热休克的 HepG2 细胞对比，有 34 条基因表达发生变化， 19 条基因变化是榄香烯特异的，如肝特异转录因子 HNF-6mm×200mm 转录增加，肝再生因子（LRF） 的基因表达下降，细胞周期调控因子 CDC25μmHu2 的基因表达降低，凋亡相关分子 BBC3、TRIP 的基因表达下降等，采用 RT-PCR 方法验证了 BBC3 和 TRIP 基因的变化 ［6mm×200mm］。 本实验在上述研究工作的基础上研究了榄香烯联合生物大分子合成的抑制剂对 Hca-F 的增殖、存活、凋亡、细胞周期及形态学改变的影响。结果表明本实验所用三种生物大分 子合成抑制剂都不能阻断榄香烯的抗瘤作用。THP 可嵌入 DNA 双链中，抑制 DNA 聚合酶 的活性，从而抑制 DNA 的复制与转录。拓扑替康能够抑制拓扑异构酶，从而抑制 DNA 复 制。两药都不能阻断榄香烯的抗瘤作用。放线菌酮是真核细胞蛋白质合成的抑制剂，能特 异阻断蛋白质的合成，许多实验常用放线菌酮预处理观察药物作用及细胞代谢、功能、凋 亡等过程对新的蛋白质生物合成的依赖性［7］。放线菌酮预处理并不能阻断榄香烯对 Hca-F 细胞增殖的抑制作用，表明榄香烯抗肿瘤作用对新的蛋白质表达依赖性较低。结合 榄香烯处理后瘤细胞形态学的变化，提示榄香烯作用于肿瘤细胞膜或细胞中的某些蛋白质 （如酶）等直接杀伤肿瘤靶细胞。由于榄香烯分子小，抗癌作用比较独特，尤其是不与其 他抗癌药有交叉耐药性，与其他抗癌药联合应用是值得探讨的问题。本实验结果表明榄香 烯和拓扑替康、THP 合用可使其抗癌作用增强，这对榄香烯联合其他药物治疗肿瘤可能有 一定参考意义。