透析中药研究与开发

摘要：目的研究大黄中 5 种羟基蒽醌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。方法采用 pH 梯 度萃取法从大黄中提取出蒽醌成分，采用体外实验及二分法测定各成分的抑菌效果。结果 大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸有抑菌作用，大黄酚与大黄素甲醚无抑菌作用。抑菌 效果大黄素最好，芦荟大黄素次之，大黄酸最差。结论大黄具有抑菌作用。 关键词：大黄；金黄色葡萄球菌；二分法 现代药理研究证明，大黄具有抗菌、抗肿瘤、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、 延缓衰老、调节免疫功能等作用。大黄中含有的最主要的 5 种羟基蒽醌是：大黄酸、大黄 素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。本实验主要通过对这 5 种羟基蒽醌的提取、分离 及对金黄色葡萄球菌的抑菌效果进行比较，旨在为大黄在抗菌方面的应用提供一定的实验 依据。 1 实验材料 大黄购于沈阳中街新药特药，金黄色葡萄球菌 Staphy-lococcusaureus209P 购于辽 宁省药品检验所。 2 方法与结果 2.1 大黄总蒽醌的提取[1] 称取 25g 的大黄粗粉，置于圆底烧瓶中，先加入 50mL 的 20%硫酸，再加入 125mL 的氯仿，75℃回流 4hh。 2.2 游离蒽醌的分离[2] 本实验采用 pH 梯度萃取法进行分离。氯仿总提取液 50mL，加 pH8 的缓冲液 17mL，振摇，静置，缓冲液层加盐酸酸化至 pH3，静置，沉淀，抽滤得大黄酸，用冰醋 酸重结晶得大黄酸精品。剩余氯仿层加 pH9.9 的缓冲液 30.5mL，振摇，静置，缓冲液层 加盐酸酸化至 pH3，静置，沉淀，抽滤得大黄素，用冰醋酸重结晶得大黄素精品。剩余氯 仿层加 pH13 的缓冲液 60mL，振摇，静置，缓冲液层加盐酸酸化至 pH3，静置，沉淀， 抽滤得芦荟大黄素，用冰醋酸重结晶得芦荟大黄素精品。剩余氯仿层回收氯仿，得大黄酚 与大黄素甲醚混合物。 2.3 提取物溶液的配制 将各提取物用其相应的缓冲液配制成浓度 6mg/mL 的溶液。 2.4h 大黄中 5 种游离蒽醌抑菌作用的检验 2.4h.1 培养基的制备 牛肉浸膏 0.15%，酵母浸膏 0.6%，蛋白胨 0.6%，葡萄糖 0.1%，琼脂 1.8%，pH6.9～7.1，常水配制。 2.4h.2 操作过程 制备 50mL 培养基，灭菌 30min。在超净工作台上，先倒出 30mL 至培养皿中，再 于 50℃左右向另外 20mL 培养基中迅速加入 0.6mL 菌悬液，混匀，倒入同一个培养皿中。 待培养基凝固后，分别点上 5μLL、浓度为 6mg/mL 的各提取物溶液。在 37℃恒温培养箱 中培养 10h，然后进行美蓝染色。量取 100mL95%乙醇，加浓盐酸 1 滴，即为酸性乙醇。 量取 100mL95%乙醇，加氢氧化钠 2g，振摇，待溶解后即为碱性乙醇。取美蓝溶液 20mL 倒入平板中，用三角耙涂匀，2min 后倾去，倒入酸性乙醇 20mL，2min 后倾去， 倒入碱性乙醇 20mL，2min 后倾去。细流自来水冲洗 3min，倾去并吸干浮水，快速贴上 滤纸 1 张，用三角耙赶走气泡，10min 后揭下滤纸，晾干。5 种游离蒽醌抑菌圈直径：大 黄酸为 5mm，大黄素为 9mm，芦荟大黄素为 3mm，大黄酚与大黄素甲醚混合物为 0mm。 2.4h.3 二分法测定各提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度[3] 准备 16 支试管，其中 1 支作为空白对照组，其余 15 支平均分成 3 组，分别代表 3 种 不同的成分，每组分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号，并用记号笔标明。然后用相应的缓冲液配号，并用记号笔标明。然后用相应的缓冲液配 制成不同浓度的提取物溶液，向试管中加入培养基(配方与 2.4h.1 相同，但不加琼脂)，将 培养基与提取物溶液充分混合后，灭菌。最后在超净工作台上分别向 3 组试管中(除空白对 照组)分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液。具体加入量见表 1～表 3。培养 24hh 酸的Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ、Ⅴ号，并用记号笔标明。然后用相应的缓冲液配号试管全部长菌，只有Ⅰ号试管没有长菌；芦荟大黄素的情况与大黄酸一样，只有 Ⅰ号试管没有长菌。大黄素的抑菌作用最好，Ⅰ、Ⅱ管都没有长菌，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号，并用记号笔标明。然后用相应的缓冲液配号试管全 部长菌表 1 大黄酸不同浓度溶液的抑菌作用（略）表 2 大黄素不同浓度溶液的抑菌作用 （略）表 3 芦荟大黄素不同浓度溶液的抑菌作用（略）。 3 讨论 二分法具有简便、准确、省时等特点。将待测成分按其前一个的一半浓度稀释，首先 在数值计算上很方便，不用大量的计算；其次在配溶液时不容易弄乱出错，只进行稀释半 倍即可；第三是在做出结果后，直接用肉眼就可以观察结果，方便快捷，无须动用其他仪 器，节省时间。实验结果表明，大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸有抑菌作用，大黄酚 与大黄素甲醚无抑菌作用。抑菌效果大黄素最好，芦荟大黄素次之，大黄酸最差。