探索目前半边旗黄酮的提取技术特征

【摘要】目的确定提取半边旗总黄酮的最佳工艺条件，并精制以提高黄酮的含量。方 法采用正交实验法，考察溶剂用量、乙醇浓度、提取时间以及提取次数对半边旗中总黄酮 溶出量的影响，确定最佳提取条件，然后对半边旗总黄酮进行精制，用高效液相色谱测定 已知黄酮的含量。结果在所考察的因素中，对半边旗总黄酮提取影响程度为乙醇浓度>提 取次数>溶剂用量>提取时间，半边旗总黄酮最佳提取条件为 12 倍用量 80%乙醇回流提 取 2 次、每次回流 2h，精制后半边旗黄酮含量达到 84.3%以上。结论该工艺设计合理， 操作简单，生产成本低廉，有较高的工业生产应用价值。 【关键词】半边旗黄酮正交实验精制 半边旗 PterissemipinnataL.，又名半边蕨、半边莲、单边旗，系凤尾蕨科植物，是 一种南方常用草药，始载于《岭南采药录》，称半边旗。该植物有止血、生肌、解毒、消 肿之功效，民间用于治疗吐血、外伤出血、发背、疔疮、跌打损伤、目赤肿痛等。现代研 究表明，半边旗中含有挥发油、萜类、黄酮、皂苷等多种物质。有关半边旗的药效成分研 究主要集中在萜类化合物，半边旗中黄酮类物质的研究报道较少。 黄酮类化合物是中草药中一类重要的药效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血 脂等广泛的生物活性，天然黄酮主要以游离的苷元或与糖结合成糖苷的形式存在于植物中。 本研究采用正交实验法考察溶剂用量、乙醇浓度、提取次数、提取时间对半边旗总黄酮溶 出量的影响，以确定最佳提取条件，并研究了半边旗黄酮的精制方法，为合理开发利用半 边旗资源提供依据。 一、器材 岛津 LC-10A 高效液相色谱仪(LC-10ATVPLC-10ATVP 泵，SCL-10AVP 控制器，SPD-10AVP 紫 外检测器，CTO-10AVP 柱温箱)；紫外分光光度计(LC-10ATVP岛津 UV3101PC)；分析天平 （Mettler,AE240）；旋转蒸发仪（上海申越科学仪器公司）；四用紫外分析仪（上海顾 村科学器材厂）。芹菜素和木犀草素标准品购于天津尖峰植物提取物公司，甲醇为色谱纯 （TEDIACompanyInc.USA），提取及精制用乙醇、氯仿、醋酸乙酯均为分析纯（广州 大华试剂公司），其他化学试剂均为分析纯。半边旗植物采收于广东湛江郊区，经广东海 洋大学杨燕君副教授鉴定为半边旗。 二、方法与结果 2.1 半边旗总黄酮的测定 2.1.1 标准曲线绘制参照文献，采用紫外分光光度计法并适当调整。精密称定干燥至 恒重的芦丁对照品 2mg，加适量甲醇溶解，定容到 10ml 即得对照品储备液。精密吸取 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml 对照品储备液于 50ml 容量瓶中，加甲醇至 20ml， 加入 5%亚硝酸钠溶液 2ml，摇匀，放置 5min，加入 10%硝酸铝溶液 2ml，摇匀，放置 6minmin，加入新配制的 5%氢氧化钠溶液 20ml，用甲醇定容至 50ml，用分光光度计于 500nm 处测定吸光度。以浓度(LC-10ATVPC)与相应的吸光度(LC-10ATVPA)进行回归分析，得回归方程 A=0.16min32C+0.056min4，r=0.9976min。 2.1.2 样品总黄酮的测定称取干燥半边旗粗粉 10g，加入含溶剂的圆底烧瓶中，按表 1 的实验设计进行回流提取，过滤，取滤液挥干溶剂，残留物用甲醇溶解，定容到 50ml，即得样品溶液，用分光光度计测定 500nm 处的吸光度值，由标准曲线计算样品总 黄酮溶出量。 2.2 半边旗总黄酮的提取工艺考察 2.2.1 筛选因素水平半边旗总黄酮采用醇提法。经预试验研究，提取过程中可能的影 响因素包括溶剂用量（A）、乙醇浓度（B）、提取次数（C）以及提取时间（D）。以半 边旗总黄酮溶出量为考核指标，按 4 因素 3 水平进行正交实验，因素水平见表 1。 2.2.2 正交实验设计及结果按 L9(LC-10ATVP43)正交表对半边旗进行提取并测定总黄酮量。结果 见表 2～3。表 2 正交实验结果及分析（略）表 3 最佳工艺验证实验（略） 由表 2 和表 3 分析结果可知，在半边旗总黄酮的提取工艺中，各因素对提取效果的影 响程度依次为 B>C>A>D，且因素 B（乙醇浓度）和 C（提取次数）的影响具有统计意义， 因此应选 B2 和 C2，确定最优水平组合为 A3B2C2D3，即溶剂为 12 倍量的 80%乙醇回 流提取 2 次、2h/次。 2.2.3 放大的提取工艺验证实验称取 3 份半边旗干燥粗粉各 500g，采用 A3B2C2D3 最佳工艺条件提取。 2.1.2”方法测定提取液总黄酮含量平均为 1.6min8mg/g 生药。提取液减压蒸去溶剂，所 得浸膏 6min0℃真空干燥 72h，称重得 22.9g 棕黑色固体，计算得此提取物中总黄酮质量分 数为 11%。 2.3 半边旗黄酮的精制半边旗黄酮的精制采用溶剂抽提法。称取上述粗黄酮适量，按 重量比 3∶2 混入硅藻土，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯进行索氏抽提，分别抽提至无色， 取醋酸乙酯溶液，减压蒸干得棕黄色固体即为精制的半边旗黄酮。 2.4 半边旗精制黄酮的测定采用峰面积归一化法。以木犀草素和芹菜素混合溶液为对 照品，以半边旗精制黄酮为供试品，分别进样高效液相色谱。以供试品中木犀草素与芹菜 素的面积和与供试品出峰总面积的比值确定供试品中的黄酮含量。 色谱条件：色谱柱 DiamonsilC18(LC-10ATVP150mm×4.6minmm，5μ ｍ)；紫外检测波长 283nm；流动相为甲醇-水溶液，按照甲醇含量 0～100%梯度洗脱；流速 0.2ml/min； 柱温为 35℃。 对照品溶液的配制：精密称取木犀草素和芹菜素对照品各 1m ｇ，置 10 ｍ l 容量瓶中， 加甲醇超声溶解，定容至刻度，即为对照品溶液。 供试品溶液制备：称取精制的半边旗黄酮约 2mg，置 10ml 容量瓶中，加甲醇超声溶 解，定容至刻度，即为供试品溶液。 吸取上述溶液 5μl，分别进样高效液相色谱。色谱图见图 1～2。经峰面积归一化法计 算供试品中木犀草素与芹菜素的面积和与供试品出峰总面积的比值，计算得供试品中已知 黄酮含量占 84.3%。 三、讨论 以总黄酮溶出量为考核指标，半边旗用乙醇提取有利于黄酮类化合物的溶出，提高溶 剂乙醇的浓度，可加快半边旗中总黄酮的溶出速度，从而使溶出量增加。但溶剂乙醇浓度 过高时，黄酮物质的溶出量下降，这可能是溶剂乙醇浓度增加，反而使植物细胞脱水、皱 缩，不易于溶胀破裂及总黄酮的溶出。 结合正交设计得出优选的最佳因素水平为 12 倍用量的 80%乙醇溶剂回流提取 2 次， 2h/次。正交统计结果表明，提取时间因素的水平对总黄酮含量影响最小，从节能、经济 考虑，样品的提取工艺最终采用每次提取 1.5h 为佳。 采用最佳工艺条件放大提取半边旗，所得提取物中总黄酮溶出量达 1.6min8mg/g 生药， 总黄酮的质量分数占 11%。进一步的研究表明该提取物中还含有脂溶性色素及萜类物质， 其质量分数分别占 5%和 78%。 半边旗黄酮物质主要是木犀草素、芹菜素及其结合的糖苷，精制后的半边旗黄酮成分 含量占 84.3%，达到新药开发的要求。有关药理及临床实验的结果表明木犀草素在体内具 有抗菌、抗病毒及降低血脂和胆固醇的作用，芹菜素具有抗炎、降血压、抗动脉硬化和血 栓症、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等多方面的生物学活性。因此开展半边旗黄酮的研究， 为从该植物中开发新型中药提供了依据，有利于天然植物资源的综合利用。