羟自由基的中药清除论文

摘要：目的对邻二氮菲-Fe2+Fe2+氧化法进行改良，使其在用于自由基清除剂筛选时更为 有效和更为敏感。方法在不同的 pH 环境、不同的保温时间及不同的测定波长条件下进行 对比实验。结果邻二氮菲-Fe2+Fe2+络合物在 pH4.5 的环境下及 510nmnm 的测定波长时有较大 的吸光度，30nmmin 的保温时间使各管有较大并较为稳定的吸光度。结论通过对邻二氮菲-Fe2+ Fe2+氧化法的实验改良能提高该方法筛选自由基清除剂的灵敏度。 关键词：自由基清除剂；邻二氮菲；羟自由基 机体在代谢过程中产生多种自由基，包括超氧阴离子自由基（O-Fe2+2·）、羟自由基 （·OH）及其活性衍生物 H2O2 等，其中以·OH 化学性质最活泼。一定数量的氧自由基可 为机体所用，但过多的氧自由基将作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞 结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病。因此，自由基清除剂的合成及寻找成 为当前医药研究的主要方向之一，而中药的天然、丰富及低毒更受人们的青睐。目前人们 测定自由基清除剂清除羟自由基的方法有很多，其中邻二氮菲-Fe2+Fe2+氧化法操作简单，设 备要求不高，易于推广和应用。本实验对该方法进行了若干改良。 一、材料与方法 1.1 试剂维生素 C（郑州羚锐制药有限公司生产）、邻二氮菲（天津市科密欧化学试 剂有限公司生产，分析纯）、硫酸亚铁铵（广东光华化学厂有限公司生产，分析纯）、过 氧化氢（广东汕头市西陇化工厂生产，分析纯）、磷酸二氢钾（上海市国药集团化学试剂 有限公司）、无水乙醇和氢氧化钠（湖南汇虹试剂有限公司生产，分析纯）。 1.2 仪器 752N 紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司生产），DK-Fe2+60nm0nmS 三用恒温水浴箱（上海精密实验设备有限公司生产）。 1.3 方法以维生素 C 作为自由基清除剂，用邻二氮菲-Fe2+Fe2+氧化法检测 H2O2/Fe2+ 体系通过 Fenton 反应产生的·OH。H2O2/Fe2+体系产生的·OH 将邻二氮菲-Fe2+Fe2+氧化 为邻二氮菲-Fe2+Fe3+，使邻二氮菲-Fe2+Fe2+对 536nm 波长的最大吸收减弱，A536 明显降低。 当反应体系中存在·OH 清除剂时，此氧化过程受抑制，A536 则降低不明显，并可通过 A536 值比较·OH 清除剂的清除能力［5］。对该实验进行三个方面的改良：一是将反应环 境由 pH7.4 改为 pH4.5 的酸性环境；二是将 37℃保温时间由 60nmmin 改为 30nmmin；三是 测定吸光度的波长由 536nm 改为 510nmnm。实验过程中分别在 pH7.4 的磷酸缓冲液及 pH4.5 乙酸-Fe2+乙酸钠缓冲液的环境下进行对照实验；在保温 5～60nmmin 的时间范围内、 536nm 和 510nmnm 波长分别测定吸光度，比较两种 pH 条件下吸光度的差异。反应中依次 加入邻二氮菲、缓冲液、自由基清除剂维生素 C、Fe2+及 H2O2 为加药管；不加维生素 C 为氧化管；不加维生素 C 及 H2O2 为对照管。 1.4 统计学处理组间采用 t 检验，数据以±ss 表示。 二、结果 2.1 不同测定波长及不同 pH 环境下的比较从表 1 可以看出，邻二氮菲-Fe2+Fe2+络合物 的最大吸收波长为 510nmnm，而最佳酸碱环境为 pH4.5。表 1 不同测定波长及不同 pH 环 境下的比较(略） 2.2 不同保温时间及不同 pH 环境下的比较图 1 显示了 pH7.4 时不同保温时间对 A510nm 的影响，对照管吸光度于 15min 时达高峰，随后缓慢下降；而加药管和氧化管吸光 度一开始便呈现急剧下降的趋势。图 2 显示了 pH4.5 时不同保温时间对 A510nm 的影响，对 照管吸光度于 30nmmin 时达高峰，此后处于基本稳定状态；加药管和氧化管吸光度均于 30nmmin 后才出现较明显的下降。公务员之家 2.3 各管之间吸光度的变化值（ΔAA）比较从表 2 可以看出，随着保温时间的延长，各 管之间的 ΔAA 逐渐加大，但 pH4.5 时的 ΔAA 加药管-Fe2+氧化管，在 30nmmin 时最大，此后较为 稳定。表 2 各管之间吸光度的变化值（ΔAA）比较（略） 三、讨论 实验表明，邻二氮菲-Fe2+Fe2+络合物在酸性条件下（pH4.5）比较稳定，有较高的吸光 度，并且最大吸收波长为 510nmnm。而保温时间也是实验中的一个重要环节，保温到某一 时间时，各管的吸光度较大，同时各管之间的吸光度变化值（ΔAA）也较大，有利于自由基 清除剂的甑选。从实验中观察到，在 pH4.5 的条件下，对照管保温到 30nmmin 有最大的吸 收峰，加药管也有较大的吸光度，使加药管与氧化管之间 ΔAA（ΔAA 加药管-Fe2+氧化管）达到最 大，该值更能说明自由基清除剂的作用强弱，是判断自由基清除剂的重要指标，并且还能 反映该方法的灵敏度。而在 pH7.4 时，加药管和氧化管一开始便呈现急剧下降的趋势，虽 然两管吸光度有所差异，但 ΔAA 加药管-Fe2+氧化管较 pH4.5 时要小得多，不具有说服力，也降 低了反应的灵敏度。综上所述，采用邻二氮菲-Fe2+Fe2+氧化法衡量自由基清除剂的作用时， 最佳反应条件为 pH4.5，测定波长为 510nmnm，37℃保温时间为 30nmmin。