杜仲叶中绿原酸的提取论文

1 器材与方法 1.1 材料与仪器杜仲叶，购于北京某地区，为初秋采集叶。绿原酸标准品（中国药品 和生物制品鉴定所）；丙酮、正丁醇、冰乙酸均为分析纯（上海试剂公司）；实验用水为 去离子水。Unic-2100 型紫外可见光分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；RE52AA 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；365nm 紫外分析仪（上海科艺光学仪器 厂）；SHZ-III 循环水多用真空泵（上海亚荣生化仪器厂）。 1.2 方法 1.2.1 杜仲叶中绿原酸含量的测定采用纸层析-紫外分光光度法［15］。 1.2.2 提取单因素实验随机称取 5g 干燥的杜仲叶粉（20 目），置于 250ml 平底烧瓶 中，采用不同的实验方法设计进行提取。改变提取条件以确定提取因素变化范围以及各因 素的较佳值。每次提取液过滤，真空蒸发去除丙酮后，用去离子水定容至 100ml，测定绿 原酸的含量，并折算为每 100g 干叶中的提取得率。 1.2.3 正交实验设计在提取单因素实验的基础上，采用正交实验优化工艺条件。以丙 酮浓度、浸提温度、浸提时间、料液比 4 个因素作为考察对象，每个因素选用 3 个水平。 选用 L9（34）表，并安排实验，优化工艺条件。 2 结果 2.1 丙酮浓度对提取率的影响 在提取温度 35℃，料液比 1∶12，提取时间 2h，丙酮浓度对绿原酸提取率的影响见图 1。由图 1 可以看出，当浓度低于 40%时，随着丙酮浓度的增加，绿原酸的提取率升高， 用 40%丙酮的提取，其提取率最高。随后，绿原酸的提取率随丙酮的浓度的升高而降低。 2.2 温度对提取率的影响 不同提取温度对绿原酸提取率的影响见图 2。从图 2 可以看出，随着提取温度的升高， 其提取率增加，当温度高于 55℃时，不再增加。这是由于温度升高，分子运动加快，有 利于分子的扩散，有利于活性物质的溶出；当温度过高时，丙酮气化，不利于活性成分的 析出，而且温度过高，杂质溶出量也相应增大，活性成分易分解破坏。 2.3 料液比对提取率的影响 不同料液比对绿原酸提取率的影响见图 3。随着溶剂量的增加，浸提效果也随之增高， 但提高幅度减小。当料液比超 1∶12 时，它们的提取率无明显变化。料液比过大给后续蒸 发工序造成困难，且成本增大，因此，料液比采用 1∶12 左右为宜。 2.4 提取时间对提取率的影响 在提取液中，当植物材料细胞内外活性成分含量未达到平衡时，提取率随提取时间的 延长而增加。一旦细胞内外浓度达到平衡，活性成分不再溶出。提取时间对绿原酸提取率 的影响见图 4。 从图 4 可以看出，随着提取时间的增加，绿原酸的提取率不断提高，尤其是从 1h 延 长到 2h 时，绿原酸提取率提高幅度较大，提取时间在 2h 和 3h 之间绿原酸提取率基本保 持稳定趋势。而提取时间在 3h 以后绿原酸提取得率呈现出缓慢上升趋势。 2.5 提取次数对提取率的影响 在其它条件不变的情况下，提取次数对绿原酸提取率的影响见图 5。从图 5 可以看出， 提取次数多，绿原酸的提取率高。当提取次数超过两次时，提取率增加不明显。所以，提 取次数以两次为好。 2.6pH 值对提取效果的影响 在固定料液比 1∶12，提取温度 35℃，提取时间 2h 的情况下，用不同 pH 的 40%丙 酮提取，浸提剂 pH 对提取效果的影响见图 6。 从图 6 可以看出，对于绿原酸的提取，当 pH 值低于 4 时，随着 pH 值的增加提取率 增加；当 pH=4 时，绿原酸的提取率达到最大；当 pH 值再增加时，提取率下降。绿原酸 是极性有机酸，在酸性介质中比较稳定，因此，绿原酸的提取，宜在酸性溶剂中进行。但 是，无论是碱性溶剂提取还是酸性溶剂提取，都会影响废水的排放处理，从产业化和环境 保护考虑，其均不宜在酸性或碱性溶剂中提取，宜在中性水溶液中进行，因此，pH 值对 提取率的影响在以后的工艺条件优化中不做考虑。 2.7 丙酮-水溶液提取绿原酸工艺条件的优化从以上单因素可知，杜仲叶绿原酸在提取 过程中，受到浸提时间、温度、丙酮浓度和丙酮溶液用量等因素的影响。为探索最佳提取 条件，在单因素的基础上，对上述 4 个因素分别取 3 个水平，采用 L9（34）正交实验设 计进行优化，各因素和水平如表 1。正交实验方案和结果见表 2。各因素与绿原酸提取率 的关系直观图见图 7。表 1 影响绿原酸提取率的因素及水平数（略）表 2 绿原酸提取正交 实验表 L9（34）（略） 对正交实验有关数据作极差分析，结果见表 2。由表 2 可知，各因素对绿原酸提取率 的影响程度依次为 C＞A＞B＞C。在 4 个影响因素中，料液比、温度对提取率影响较大， 其次是丙酮浓度，影响最小的是浸提时间。由图 7 表明，以绿原酸提取率为考察指标，依 次最佳工艺条件是 A3B2C2D3，各因素的最佳水平分别是：浸提温度 65℃，浓度 40%，料液比 1∶12，浸提时间 3h。说明绿原酸提取率明显受到温度的影响，因为升高温 度，增加分子的热运动，使溶剂和叶粉分子间的传递加速，有利于绿原酸的浸出。但绿原 酸为热敏性物质，温度过高，会造成绿原酸的分解，并引起丙酮汽化挥发损失。因此温度 控制在 65℃以下。丙酮的浓度对提取率的影响次之，随着浓度增加，溶剂极性降低，同 绿原酸的极性差拉大，不利于绿原酸的浸出。料液比的增大，溶剂与叶粉固体溶质间的浓 度差增大，有利于传质，因此，绿原酸提取率增大。料液比增大，虽然有利于传质，但料 液回收量增加影响成本。因此，料液比应控制在 1∶12 为最佳。浸提时间延长，有利于提 取率的增加，但时间过长，绿原酸分解，反而降低绿原酸的含量，时间过短，也不利于绿 原酸的浸提，应控制在 3h 以内为宜。 在提取过程中发现，丙酮-水体系作浸提剂，其提取液中蛋白质、黏液含量减少，而糅 质含量增加，蛋白质在丙酮中的溶解度较小，而丙酮-水体系为糅质的最佳溶剂［14］； 提取液始终呈褐色，叶绿素等色素析出较少。因此，采用丙酮-水体系避免了醇溶性色素的 大量析出，有利于绿原酸的分离和纯化。但缺点是丙酮溶液提取，其绿原酸提取率相对于 水溶液提取和醇溶液提取低。 2.8 最佳条件下的放大验证实验取 100g 干燥粉碎的杜仲叶装入 2000ml 烧瓶中，在 最佳提取条件下浸提，重复实验 3 次取平均值。结果见表 3。表 3 丙酮提取工艺验证实验 结果（略） 3 结论 采用丙酮为溶剂提取绿原酸，避免了醇溶色素的溶出，提取物纯度高，但得率稍低。 单因素实验和正交实验分析研究表明，提取杜仲叶绿原酸的最佳工艺条件：乙醇浓度 40%，提取温度 65℃；料液比 1∶12，提取时间 3h，浸提两次。通过在最佳条件下的验 证实验表明，绿原酸的提取率为 2.25%，提取物得率 17.25%，绿原酸含量 13.12%。