桑树总生物碱分析论文

1 材料与仪器 桑叶总生物碱提取物为市售产品(DNJDNJ 含量>50%)。桑叶、桑椹、桑白皮、桑枝药材 购于成都荷花池中药材专业市场，经鉴定为 Morusalba 的干燥叶、果、根皮和嫩枝。硅 胶 G（青岛海浪化工厂）、青岛海浪化工厂）、732 阳离子交换树脂(DNJ上海汇珠树脂有限公司)、中性氧化铝(DNJ成 都市科龙化工试剂厂)、活性炭(DNJ成都市科龙化工试剂厂)，其余各种试剂为化学纯或分析纯。 TU-1800 紫外可见分光光度计(DNJ北京普析通用仪器有限公司)。 2 方法与结果 2.1 桑树总生物碱分析方法的研究实验中以桑叶总生物碱提取物为样品进行了分析方 法的研究；后经证实，桑椹、桑白皮和桑枝的总生物碱实验结果与之一致。 2.1.1 检识反应与生物碱沉淀试剂的反应：取桑叶总生物碱提取物适量，加蒸馏水溶 解，以盐酸调 pH2～3，过滤，所得溶液为浅黄色，取 5 份，分别与碘化铋钾试剂、碘-碘 化钾试剂、硅钨酸试剂、磷钼酸试剂、苦味酸试剂反应，结果见表 2。表 2 桑叶生物碱的 检识反应（青岛海浪化工厂）、略） 碘化铋钾、硅钨酸、磷钼酸与样品呈阳性反应，可用于定性鉴别。 亚硝酸反应：考虑到 DNJ 属于脂肪族仲胺，应能与亚硝酸进行反应。试验时取上述桑 叶总生物碱提取物的酸水溶液，置试管中，加入亚硝酸钠水溶液，结果产生气泡，持续时 间近 1h，随着气体的逸出，试管口颜色逐渐变深，几乎呈褐色，而溶液的颜色则由浅黄色 变为深黄色。 2.1.2 薄层色谱分析桑树生物碱的薄层色谱分析鲜有报道，主要是由于 DNJ 及其类似 物显色困难。实验中取桑叶总生物碱提取物的水溶液，点样于硅胶 G 板上，以醋酸乙酯-甲 醇-冰醋酸(DNJ6∶2∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，显色，检识。曾实验碘化铋钾、磷钼酸、 碘蒸气、10%硫酸-乙醇、α-萘酚、Enrilich 试剂、苯胺-二苯胺-磷酸试剂、0.15%高锰酸 钾等薄层色谱显色剂，结果碘化铋钾显色不明显，其他试剂均未能显色。 有文献报道［18］，采用茚三酮试剂能使 DNJ 显紫色斑点。经试验，茚三酮能使样品 的薄层板显出斑点，但是，用茚三酮显色不能排出氨基酸的干扰，而亚硝酸反应产生气泡 表明样品中可能存在氨基酸。后终于找到氯-邻联甲苯胺试剂，能使样品的薄层板显红黄色 斑点。若令薄层板不显色，刮取氯-邻联甲苯胺试剂能显色的相应位置的硅胶，以甲醇洗脱， 洗脱液挥除溶剂，酸水溶解，加碘化铋钾试剂，结果呈阳性反应，表明氯-邻联甲苯胺试剂 能使桑叶生物碱显色。又取谷氨酸水溶液，与桑叶总生物碱提取物平行试验，结果，氯-邻 联甲苯胺试剂不能使谷氨酸显色。因此，桑叶总生物碱用氯-邻联甲苯胺试剂显色具有专属 性。氯-邻联甲苯胺试剂显色的具体方法为：取少量高锰酸钾置密闭容器中，加适量浓盐酸 令产生氯气，将薄层板放入，15min 后取出，置空气中 5min 以上以除去氯气，然后喷以 邻联甲苯胺溶液(DNJ160mg 邻联甲苯胺溶于 30ml 冰醋酸，加水至 500ml，再加 1g 碘化钾)， 即可显色。桑叶生物碱提取物的薄层色谱图如图 2 所示。 2.1.3 含量测定方法的提出实验发现，桑叶生物碱经氯-邻联甲苯胺试剂显色后，在 2h 内未见褪色，5h 后慢慢褪色，显色较为稳定。刮取斑点，用甲醇洗脱，取洗脱液在 200～800nm 范围内扫描，结果在 209nmnm 和 446nm 处有吸收峰，如图 3 所示。后来发 现，若样品薄层色谱中有多个斑点，这些斑点的光谱图基本一致。据此可提出含量测定方 法：以 DNJ 为对照品，用薄层色谱-分光光度法进行测定。 由于 209nmnm 属于末端吸收峰，若用于含量测定则误差较大，故宜选用 446nm 作测 定波长。经试验，甲醇洗脱液放置 2h，446nm 处的吸光度值基本不变，表明方法的耐用 性良好。因此确定总生物碱的含量测定方法可采用薄层色谱-可见分光光度法。 另外，根据斑点颜色清晰、稳定、以及不同斑点光谱图基本一致的性质，也可以考虑 以 DNJ 为对照品，用薄层扫描法进行含量测定。 2.2 桑树总生物碱提取方法的研究本文桑树总生物碱的提取、纯化是建立在对结构、 性质的分析的基础之上的。 2.2.1 根据桑树生物碱的结构推测其理化性质 溶解性：由表 1 可知，DNJ 类化合物为氮杂糖型结构，羟基较多，极性较大，因此可 溶于水、醇类溶剂，在氯仿等弱极性溶剂中、醋酸乙酯等中等极性溶剂中应不能溶解或溶 解度很小，因此，传统的生物碱提取方法(DNJ酸水提取、氯仿萃取)将不适用，但可考虑用水、 醇类溶剂提取。 碱性：由表 1 可知，桑树生物碱多为脂肪族仲胺或叔胺，因此具有弱碱性，在一定 pH 条件下能成为离子状态，故可以考虑用离子交换色谱进行纯化。另外，也以考虑使用 氧化铝等碱性吸附剂进行分离。 水解性：对于氮杂糖本身而言，其化学性质非常稳定，在酸、碱、热作用下不易分解。 但根据表 1，不少生物碱成分以糖苷的形式存在，苷在酸性条件下尤其是加热时易被水解， 因此，提取分离中若使用酸时应注意不能使作用时间太长，并应尽量避免在酸性条件下加 热。 2.2.2 桑树生物碱的提取工艺流程根据上述结构与性质的分析，本文提出了以下的提 取工艺流程。各提取步骤分别进行沉淀反应和薄层色谱跟踪分析，以保证各工序所得到的 成分为生物碱。 水提醇沉：取桑叶、桑椹、桑白皮、桑枝药材，分别加水煎煮提取，煎液浓缩至一定 体积，放冷后加乙醇使含醇量达 70%，静置过夜，滤取上清液，回收乙醇，得提取液。 离子交换树脂富集：取上述提取液，适当稀释，用 10%盐酸调 pH4～5，流经已预处 理的 732 阳离子交换树脂柱，树脂柱先以水洗至近中性，弃去水洗液，再用 0.25mol/L 氨水洗脱，收集洗脱液，适当浓缩。 正丁醇萃取：取上述浓缩液，以等量的水饱和的正丁醇萃取，共 3～4 次，分取正丁 醇层，减压回收溶剂，得正丁醇萃取物。 氧化铝柱层析：取正丁醇萃取物，用少量水溶解，上样于氧化铝干柱，以乙醇洗脱， 洗脱液回收乙醇，得氧化铝纯化物。 活性炭脱色：取氧化铝纯化物，以水溶解，加适量活性炭，煮沸 15min，放冷，过滤， 滤液浓缩除去溶剂，即得到总生物碱产品。 2.2.3 产品的初步分析 沉淀反应：取上述产品，加水溶解，以盐酸调 pH2～3，分别加碘化铋钾试剂、硅钨 酸试剂、磷钼酸试剂，结果 4 味药的总生物碱均呈阳性反应。 薄层色谱分析：薄层色谱条件同上。结果如图 4 所示。 3 讨论 中药有效成分的分析方法与提取方法建立的前提是对目标成分理化性质有充分的认识。 本文在分析桑树生物碱结构与性质的基础上，根据实验结果提出了桑树总生物碱的新的定 性定量方法和提取分离方法，方法可行性较好，但方法中的具体参数仍有待进一步研究， 所得总生物碱的含量尚待测定。 曾考虑采用酸性染料比色法进行桑树总生物碱的定量分析，但实验发现该方法干扰很 大。 亚硝酸反应中，有气体产生，表明样品应存在含伯胺基的化合物，很有可能是氨基酸。 后用谷氨酸进行亚硝酸反应，结果能产生大量气体。 薄层色谱图中，点样原点亦明显显色，表明可能有部分生物碱成分停留在原点尚未展 开，因此本文的薄层色谱条件尚需优化。 氯-邻联甲苯胺试剂使桑树生物碱显色的原理可能是：新生态氯使生物碱氯代，然后氯 代物与邻联甲苯胺发生缩合反应生成联苯醌而显黄色［19nm］。