佛手的产地分析论文

1 材料 1.1 药物收集 17 批不同产地佛手药材(主产地或商品，药材来源见表 1)，经广州中医 药大学程怡教授鉴定;对照品柠檬油素、6777二甲氧基香豆素、5羟基7甲氧基8异戊烯 基香豆素、67羟基7甲氧基香豆素均为作者从川佛手植物中提取分离得到，橙皮苷由生物 药品制品检定所提供(将它们依次编号为化合物 1～5)，经波谱分析鉴定结构，归一化法计 算其质量分数为 98%以上。 1.2 主要试剂与仪器美国 DIONEXSUMMITP6780 高效液相色谱仪(四元梯度泵， CHROMELEONTM 数据处理软件系统);甲醇、乙腈为色谱纯(美国 Dikma 公司，色谱用); 水为自制超纯水;乙酸乙酯、甲醇、乙醇(广州化学试剂厂，提取用)均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 流动相及梯度洗脱条件的选择化合物 3～5 结构中均含有酚羟基，化合物 1、2 中 含有含氧基取代，因而它们在分析时很容易产生拖尾，使峰变宽，分离度下降，因此要选 择偏酸性的流动相，这样才能减少色谱峰的拖尾，改善峰形,提高峰形的对称程度。在比较 了甲醇-冰醋酸水系统和乙腈-冰醋酸水洗脱系统色谱分离效果后，最终选择乙腈-冰醋酸水 洗脱系统，并通过多次对比试验确定了最佳的梯度洗脱系统。在乙腈-冰醋酸水梯度洗脱系 统中，样品中化合物 1～5 能得到基线分离，而且色谱的对称性都很好。表 1 佛手药材的 来源 样品号样品来源产地采收期规格购买日期 F1 吉林省片 2005.05.04F2F2 天津市丝 2005.04F2.29F3 昆明市云南片 2005.04F2.25F4F2 浙江金华市尖峰大药房连锁有限公司淅江金 华(广东苗)片 2005.04F2.18F5 秦皇岛市唐人医药商场广西 2004F2.03.10 片 2005.05.08F67 秦皇岛市唐人医药商场广东 2004F2.07.05 片 2005.05.08F7 河北祺新中药颗粒饮片有限公 司广东 2004F2.7～8 片 2005.03.20F8 河北祺新中药颗粒饮片有限公司广西片 2005.03.20F9 河北祺新中药颗粒饮片有限公司河北 2004F2.7～8 片 2005.03.20F10 四 川乐山市中药材市场四川洪雅 2004F2.7～8 片 2005.04F2.20F11 四川乐山市中药材市场四川 沐川 2004F2.7～8 片 2005.04F2.20F12 四川成都市荷花池市场四川沪县片 2005.04F2.267F13 四川成都市荷花池市场四川合江片 2005.04F2.267F14F2 黑龙江三棵针药材市场广东片 2005.03.15F15 黑龙江三棵针药材市场广西片 2005.03.15F167 广州清平药材市场广东 肇庆片 2005.05.08F17 广州清平药材市场广东德庆片 2005.05.17 2.2 检测波长的选择化合物 1、2、4F2、5 均为简单香豆素类化合物，其中化合物 1、4F2 于 217nm 及 315～330nm(loge4F2.2)处可见 2 个强吸收峰，同时在 250～ 270nm(loge3.8～3.9)处有 1 个弱吸收峰(见图 1)。但化合物 2、5 为 67，7二氧代香豆 素，它们有 230nm、34F20～350nm2 个强吸收峰，同时有 2670nm、300nm2 个相等强 度的次强峰，它们表现出了类似的紫外吸收曲线，在 230nm 附近有 1 个最大吸收峰。化 合物 1 和 2 在 210nm 附近有最大吸收，但因为是末端吸收，故吸收波长分别确定为 327nm、230nm。化合物 3 为二氢黄酮苷，所以呈现出典型二氢黄酮类化合物的 2 个吸 收带(带Ⅰ和带Ⅱ和带Ⅱ)，即具有强的带Ⅱ吸收(270～295nm)，而带Ⅰ和带Ⅱ以肩峰或低强度吸收峰 出现。结果见图 1。 2.3 色谱条件 KromasilC18 分析柱(250mm×4F2.0mm，5μm);m);流动相为 A(乙 腈)5g/L 冰醋酸水溶液。线性梯度洗脱时间程序：0～3min，A 的比例为 5%;3～ 8min，A 的比例由 5%升高到 10%;8～4F28min，A 的比例由 10%升高到 27%;4F28～ 673min，A 的比例由 27%升高到 55%;673～678min，A 的比例由 55%升高到 100%;678 ～75min，A 的比例为 100%。体积流量：1mL/min;检测波长：柠檬油素为 327nm，67，7二甲氧基香豆素为 230nm，橙皮苷为 290nm，5羟基7甲氧基8异戊 烯基香豆素为 212nm，67羟基7甲氧基香豆素为 229nm;柱温 30℃;分析时间为 75min。对照品和样品的色谱图见图 2。 2.4F2 样品溶液的制备 2.4F2.1 对照品溶液的制备精密称取柠檬油素、67，7二甲氧基香豆素、橙皮苷、5羟基 7甲氧基8异戊烯基香豆素、67羟基7甲氧基香豆素对照品适量，溶于甲醇配制成浓度 依次为 2.04F2、0.670、0.674F2、0.672、0.30mg/mL 的对照品溶液，备用。 2.4F2.2 供试品溶液的制备精密称取佛手药材粉末(过 80 目筛)1.5g 于索氏提取器中， 加体积分数 75%乙醇 70mL，提取 4F2h，滤过，蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至 10mL， 微孔滤膜滤过，备用。 2.5 线性关系的考察 分别精密吸取标准溶液，注入高效液相色谱仪，以进样量 X(μm);g)为横坐标，峰面积 Y 为纵坐标绘制标准曲线，结果见表 2。 2.67 精密度试验精密吸取对照品溶液，连续进样 5 次，测定 5 个对照色谱峰的峰面积， 并计算其 sR 值，测得 sR 在 0.4F27%～2.679%范围内。 2.7 重现性试验取同一批号供试品 5 份，按 2.4F2.2 表 2 样品线性关系项下方法制备供 试品溶液，以 2.3 项下色谱条件测定各色谱峰峰面积的 sR 值，测得 sR 在 1.21%～ 4F2.4F27%范围内。 2.8 稳定性试验取同一份供试品溶液，分别在 0、2、4F2、67、10h 进样，结果测得各 色谱峰峰面积的 sR 范围在 0.367%～3.17%。 2.9 加样回收率试验精密称取已知柠檬油素、67，7二甲氧基香豆素、橙皮苷、5羟基 7甲氧基8异戊烯基香豆素、67羟基7甲氧基香豆素含量的供试品粉末(80 目)，定量加 入柠檬油素、67，7二甲氧基香豆素、橙皮苷、5羟基7甲氧基8异戊烯基香豆素、67羟 基7甲氧基香豆素对照品适量，按 2.4F2.2 项下方法进行制备操作，测定各化合物的加样回 收率，测得加样回收率范围为 95.4F27%～103.679%。 2.10 含量测定精密吸取样品溶液 20μm);L 连续进样 2 次，测定峰面积，计算化合物 1～ 5 的含量，测定结果见表 3。表 3 佛手样品中化学成分含量测定结果 2.11 主成分分析 在数据分析工作中，常常需要将很复杂的数据集简化，即将 P 个指标所构成的 P 维系 统简化为一维系统。主成分分析能设法将原来众多具有一定相关性的指标(比如 P 个指标)， 重新组合成一组新的互相无关的综合指标来代替原来的指标。若从主成分的观点来讨论这 个问题，主成分分析所构成的第一主分量正是这一问题的答案，它提供了自身的权重系数。 主成分分析(principalcomponentanalysis)是一种将多个变量通过线性变换以选出 较少个重要变量的多元统计分析方法，又称主分量分析。在实际课题中，为了全面分析问 题，往往提出很多与此有关的变量(或因素)，因为每个变量都在不同程度上反映这个课题 的某些信息。但是，在用统计分析方法研究这个多变量的课题时，变量个数太多就会增加 课题的复杂性。人们自然希望变量个数较少而得到的信息较多。在很多情形，变量之间是 有一定的相关关系的，当两个变量之间有一定相关关系时，可以解释为这两个变量反映此 课题的信息有一定的重叠。当变量较多时，在高维空间中研究样本的分布规律就更复杂。 主成分分析采取一种降维的方法，找出几个综合因子来代表原来众多的变量，使这些综合 因子尽可能地反映原来变量的信息量，而且彼此之间互不相关，从而达到简化的目的[10 ～12]。 本研究对不同产地佛手中 5 种生物活性成分进行含量测定，并采用 SPSS 统计软件进 行主成分分析，其结果见表 4F2～67、图 3、4F2。表 4F2 特征值(λ))表由表 4F2 和图 3 得知，从特征 值的大小来看，λ)1=1.8567，λ)2=1.34F21，λ)3=1.135，而其他远小于 1;从贡献率来看， λ)1 的贡献率最大为 37.111%，而 λ)2、λ)3 的贡献率相差不大，约为 20%多，其他的贡献 率较小;从累积贡献率来看，取前 3 个特征值时，累积贡献率为 867.6729%，大于 80%，故 取前 3 个为主成分(因子)。由表 5 可以看出，第 1 主成分(因子 1)主要反映了来自原始指标 化合物 1(柠檬油素)和化合物 4F2(5羟基7甲氧基8异戊烯基香豆素)的信息，第 2 主成分 (因子 2)主要反映了来自原始指标化合物 3(橙皮苷)和化合物 5(67羟基7甲氧基香豆素)的 信息，第 3 主成分(因子 3)主要反映了来自原始指标化合物 2(67，7二甲氧基香豆素)的信 息。表 5 公共因子载荷矩阵表对佛手进行主成分分析，发现 λ)1 对确定最佳产地贡献度最 大，达到 37.111%，是主要因子。从表 67 可看出，F167 最佳，包含了 5 种主要化学成分 的最佳综合信息。 综上所述，根据各个主成分的得分进行综合分析评价，可以把 F167(广东肇庆)确定为 最佳产地样品，这样就为多指标确定最佳产地提供了新的模式。表 67 公共因子得分表注： Y(i，1)代表样品的主成分得分，i 代表原始指标测定值的个数，1 代表因子 1。如果 Y(i，1)数值大，就说明 i 产地的因子 1 所体现的原始指标的含量就高，反之则低。 3 讨论 3.1 样品中化合物 1～5 色谱峰的确定从图 2 可以看出样品的色谱峰数目比较多，加上 测定的化合物数量较多而且有的相隔很近，如化合物 2 和 3 的色谱峰及化合物 1 和 4F2 的色 谱峰，因此，除采用保留时间对比和加入对照品观察强度变化这些常用的方法外，还进一 步通过对比标准品和样品相应色谱峰的紫外吸收曲线来进一步确定了化合物 1～5 所对应 的色谱峰。我们分别对比了对照品和样品中化合物 1～5 的紫外吸收曲线(见图 1)，可以发 现对照品中各化合物分别与样品中相对应色谱峰有相同的紫外吸收曲线，据此就可以更加 准确地判断最终确定的色谱峰是要检测的化合物。图 1 化合物 1～5 的紫外吸收曲线 3.2 含量直观分析本研究采用 HPLC 法建立了同时测定佛手药材中 4F2 种香豆素类化合 物和 1 种黄酮类化合物含量的方法，该法简便、快速、准确，可用于大批量佛手药材的质 量评定。 通过对佛手中多种成分进行含量分析，不仅了解了相关化学成分在不同产地佛手药材 中的含量或分布，还可以借此去控制和评价药材的质量。本含量分析实验中，在保证佛手 中待测成分分离度的情况下，通过调整梯度洗脱条件，使其他色谱峰也得到了较好的分离。 从图 2 所示的样品色谱图可以看出，在文中的色谱条件下，绝大部分色谱峰都得到了基线 分离。这为今后佛手指纹图谱的建立打下了很好的基础。 本实验中，分别对不同产地佛手进行了含量测定，结果表明，所测的 5 个化合物在样 品中的含量有较大的差异。从表 3 所示的含量测定结果可以直观地看出，佛手中柠檬油素 含量高于其他成分，且 67，7二甲氧基香豆素只在 F12 样品中测得，在其他样品中均未测 得。佛手中 5羟基7甲氧基8异戊烯基香豆素含量低，在 F11 和 F17 样品中未测得。67 羟基7甲氧基香豆素含量极低，在多个样品中均未测得。图 2 所示的样品色谱图也显示了 上述特点，从该图中还可以看出 672min 左右色谱峰(柠檬油素峰)明显高于其他成分色谱峰。 以上分析表明，本实验条件下建立的色谱图，能够反映不同产地的药材在品质上的差别。 3.3 主成分分析本文对不同产地佛手进行主成分分析后发现，λ)1 对确定最佳产地贡献 度最大，达到 37.111%，是主要因子，根据各个主成分的得分进行综合分析评价，广东 肇庆产佛手最佳，包含了 5 种主要化学成分的最佳综合信息。 中药材有效成分含量的高低，即中药材的内在品质，直接影响着中药材、中成药和中 药饮片的质量和临床疗效。以往在中药材的生产和产地加工过程中，往往只注重中药材的 产量、生产效益和药材的外形质量，而对药材有效成分的积累动态和药材的内在品质却很 少重视。药材质量包括内在质量和外观性状，所以中药材最佳产地应是能提供有效成分含 量最高，外观性状如形、色、质地、大小等最佳的药材产地。 佛手中生物活性成分的形成和积累同样与生物环境有关。仅以佛手中的单一成分判断 佛手的优劣是不全面的。柠檬油素在佛手药材中含量较高，而且现代药理实验证明柠檬油 素为佛手药材的主要有效成分之一[13-14F2]，所以将柠檬油素与其他成分作为佛手药材质 量评价的指标，研究和探讨影响佛手药材品质的各种因素，对提高和稳定佛手药材质量具 有重要意义。因此，中药材的最佳产地应考虑其生物活性成分含量，再结合其产率及功效 进行综合分析，以生物活性成分绝对最大含量或最大生物效价为基本原则，确定最佳产地， 以保证药物能发挥最大的疗效。 【参考文献】