双功能抗体的表达研究论文

关键词：单链抗体 单链抗体除本身的治疗作用外，还可作为载体与细胞因子等结合，构建成双功能抗体 用于肿瘤的导像治疗。据文献报道［1~3］各衍生因子两个完整基因融合成单一蛋白，经 抗肿瘤活性检测发现，融合蛋白具有双重活性，但融合蛋白的亲和性及抗肿瘤活性分别较 衍生因子的功能及活性有所变化，可能由于融合蛋白结构变化导致功能及活性的变化。利 用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质，为进一步探讨单链双功能 抗体基因融合蛋白提供依据。 1 双功能抗体的研究进展 随着分子生物学的发展，肿瘤的药敏基因治疗成为各国学者研究的热点［3~5］。将 目的基因导入靶细胞是基因治疗过程中的一个重要环节，因为目的基因导入靶细胞效率的 高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败。由逆转录病毒介导的基因转移所面临的最大问 题是病毒转导效率较低，原因之一是由于包装后难以得到稳定产生较高滴度感染性逆转录 病毒的包装细胞系。单链抗体（ScFv）是由是由 Fv 抗体衍生而来，将抗体重链可变区和轻链 可变区通过一段连接肽连接而成，ScFv 具有天然抗体的亲和力，而分子只有完整抗体的六 分之一。具有分子小、穿透力强、容易进入实体瘤周围的血液循环等特点，体内应用具有 较大的分布容积和较高的组织分布比例，ScFv 是构建双功能抗体，双特异性抗体等多种新 功能抗体分子的理想元件。一个蛋白或蛋白片段可以融合到 ScFv 片段上以配备附加的性 质，如免疫毒素的产生，是通过将一个肿瘤特异的 ScFv 或 Fab 融合到一个内源化能杀死 靶细胞的毒素上。许多细胞特异抗体可将试剂传递到肿瘤部位发挥其细胞毒元件的作用。 肿瘤特异性抗体片段已经与细胞因子融合［4~8］。在这种情况下，称免疫细胞因子的分 子注射到患者体内，在肿瘤细胞表面积聚，可以激活肿瘤附近的 T 淋巴细胞。这些融合蛋 白内在的肿瘤结合活性允许使用低浓度，没有通常与系统细胞因子注射相关的副作用。 细胞因子融合蛋白均具有衍生因子的双重活性，其中有一些的活性较各自野生型低， 或者与野生型因子的相加一致，或者其活性高于衍生因子的相加活性，人工构建的新蛋白 可能具有与衍生因子无关的新活性［9~11］。事实证明：具有不同功能域的复合蛋白质 以及连接肽的设计是今后寻找新的治疗因子的有效途径和研究方向。生物信息学可以促进 药物的发现和开发过程，即充分利用生物信息学的生物学和遗传学信息来寻找和开发以基 因为基础的药物。 2 双功能抗体的表达及其生物学性质的预测 对于 cDNA 序列包含一个完整的蛋白质编码区，重要的则是分析所编码蛋白质的功能。 蛋白质序列的生物信息学分析是从理论分析迈向实验研究的最为重要的部分。如果拟对所 感兴趣的基因投入实验研究，那么，基于生物信息学获得尽可能多的关于该基因/蛋白质的 信息是十分重要和极其重要的，尤其是当采用生物信息学的分析得到其结构功能域的信息 后，将对研究思路的制定提供重要的指导信息［12，13］。 传统生物学认为，蛋白质的序列决定了它的结构，也就决定了它的功能［14，15］。 因此，随着近 10 年来生物学分子序列信息的爆炸性增长，大大促进了各种序列分析和预 测技术的发展，目前已经可以用理论预测的方法获得大量的结构和功能信息，用生物信息 学的方法，通过计算机模拟和计算来“预测”出未知蛋白质信息或提供与之相关的辅助信息， 可以用较低的成本和较快的时间就能获得可靠的结果［16~18］。重组融合蛋白是通过 DNA 重组的方法，将功能上相关的两种蛋白用连接肽连接，以达到优化蛋白功能的目的， 如免疫毒素和细胞因子融合蛋白，并已用于肿瘤治疗。我们在构建融合蛋白之后，运用生 物信息学资源 DNAssist 核酸序列分析软件分析 ScFv-TNF-αDNADNA 序列翻译并获得了氨基 酸序列，蛋白质分析软件（ANTHEPROTV5）是由分析融合蛋白的二级结构及其理化性质。利 用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质，为进一步探讨单链双功能抗体基因 融合蛋白提供依据。构建重组导向的融合蛋白［19］，通过重组 PCR 方法在编码 ScFv 与 TNF-αDNA 的碱基之间引入酶切位点，并克隆到逆转录病毒表达载体 PLxSN 上表达，用脂质 体转染法转染 PA317 包装细胞，G418 筛选 10 天后共挑选 50 个细胞集落，扩大培养后 测定 29 个细胞集落的病毒滴度，筛选出一株 cfu>1×109/L 的感染性重组病毒产生细胞 系 C26。【参考文献】参考文献】 1StrubeRW，ChenSY.Characterizationofanti-cyclinEsinglechainFvantibodiesandintrabodiesinbreastcancercells： enhancedintracellularstabilityofnovelsFvF(c)intrabodies.JImmunolMethodsK，2002，263(1-2)：149-167. 2KimEJ，ChoD，HwangSY，etal.Interleukin-2fusionproteinwithantiCD3single-chainFv(sFv)selectivelyprotectsTcellsfromdexamethasoneinducedapoptosis.Vaccine，2001，20(3-4)：608-615. 3PengLS，PenichetML，DelaCruzJS，etal.Mechanismofantitumoractivityof asingle-chaininterleukin-12IgG3antibodyfusionprotein(mscIL12.her2.IgG3).JInterferonCytokineRes，2001，21(9)：709-720. 4ScherfU，BenharI，WebberKO，etal.Cytotoxicandantitumoractivityofarec ombinanttumornecrosisfactor-B1(Fv)fusionproteinonLeYantigenexpressinghumancancercells.ClinCancerRes，1996，2(9)：1523-1531. 5ChenP，ChenCQ，YaoLB，etal.ReconstructionandanalysisofaHumansmall molecularantibodytotumornecrosisfactoralpha.ShengwuHuaxueYuShengwuWu liXuebao，2001，33(1)：71-76. 6WuestT，GerlachE，BanerjeeD，etal.TNF-Selectokine： 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12 张成岗，贺福初.生物信息学方法与实践.北京：科学出版社，2002，126-136. 13 黄韧，薛成.生物信息学网络资源与应用.广州：中山大学出版社，2003，237306. 14GuexN，PeitschMC.SWISS-MODELandtheSwiss-PdbViewer： Anenvironmentforcomparativeproteinmodelling.Electrophoresis，1997，18(15 )：2714-2723. 15GuexN，DiemandA，PeitschMC.Proteinmodellingforall.TiBS，1999，24( 9)：364-367. 16ClaverieJM.Effectivelargescalesequencesimilaritysearches.MethodsEnzymol，1996，266：212-227 putationalgeneidentification.JMolMed，1997，75(6)：389-393. 18GelfandIM，KisterAE.Analysisoftherelationbetweenthesequenceandseco ndaryandthreedimensionalstructuresofimmunoglobulinmolecules.ProcNatiAcadSciUSA，1995 ，92(24)：10884-10888. 19 张建华，马保安，张惠中.及重组人融合基因表达载体的构建及瞬时表达.肿瘤防治 杂志，2002，9(2)：131-134. 关键词：文拉法辛；抗抑郁药 文拉法辛的研究现状 【参考文献】摘要】支拉法辛属于 5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制药，通过显著抑制 5-羟色 胺和去甲肾上腺素的再摄取而发挥抗抑郁作用，自 1994 年批准上市以来已取得较好的临 床疗效。 【参考文献】关键词】文拉法辛；抗抑郁药 【参考文献】Abstract】ObjectiveVenlafaxineisbelongedtoserotoninandnorepinephrinereuptakeinhibitorantidepressants.Ithasbeenusedwidelyinpsychiatricclini candithasachievedgoodresult.Wewilldiscussitspharmacologicmechanism、clini calusageandsiderespondentinthistext. 【参考文献】Keywords】venlafaxine;antidepressant 文拉法辛(venlafaxine)属于 5-羟色胺(5-HT)-去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制药，通过 显著抑制 5-HT 和 NE 的再摄取而发挥抗抑郁作用。它不同于三环类抗抑郁药（TCA）是由和单 胺氧化酶抑制剂（MAOI）是由，具有独特的化学结构和神经药理作用。结构式为：1-［2-(二 甲胺基)-1-(4-甲氧苯基)乙基］环己醇。本文就其目前研究现状作一综述。 1 药理作用 1.1 抗抑郁作用该药主要通过同时阻断 NE 和 5-HT 的再摄取，升高 NE 和 5-HT 浓度 而发挥双重抗抑郁作用，对多巴胺(DA)的重摄取，仅有轻微的抑制作用。对 M 胆碱受体， 肾上腺素 αDNA1、αDNA2、β 受体，组胺 H1 受体几乎无亲和力。其活性代谢产物 0-去甲基文拉 法辛亦可抑制 5-HT 和 NE 的重摄取，活性比原形药低。有研究表明，本品小剂量时主要抑 制 5-HT 的再摄取，大剂量时对 5-HT 和 NE 的再摄取均有抑制作用［1］。该药对 5-HT 再摄取的抑制作用弱于选择性 5-HT 重摄取抑制剂(SSRI)；对 NE 再摄取的抑制作用也弱 于某些三环类抗抑郁药（TCA）是由或选择性 NE 再摄取抑制药。但本品单次或多次给药均可 降低由异丙肾上腺素刺激大鼠松果体产生的 cAMP 浓度，引起肾上腺素 β 受体的快速下调， 而 TCA 则需长期给药才有此效应。现认为文拉法辛对肾上腺素 β 受体的快速下调作用与其 起效快有关。 有研究表明，此药可使正常人注意力集中，增强记忆力，加快反应速度，改善智力， 且对主要驾驶参数（横向偏离水平）是由及一系列精神运动均无明显影响，但影响警觉。对于 抑郁病人，一般用药 1～2 周后(也有 4 天内)即可出现明显抗抑郁作用，比 TCA 起效快。 1.2 对睡眠的影响该药可使总的睡眠时间减少，觉醒时间增加，总的快波睡眠时间 (REM)缩短。阻断抑郁病人 REM 睡眠可产生缓慢而持久的症状改善，故此药对睡眠的影 响可能参与抗抑郁作用。 1.3 镇痛作用腹腔注射此药可提高小鼠的痛阈，半数有效量(ED50)为 46.7mg/kg。 这种作用可被纳洛酮(naloxone)明显抑制，但不被 βFNA 或 naloxonazine 所抑制。肾上 腺素 αDNA2 受体阻断药育亨宾(yohimbine)能削弱其镇痛作用，而肾上腺素 αDNA2 受体激动剂可 乐定(clonidine)可增强其作用。提示阿片 κ、δ 受体，肾上腺素 αDNA2 受体与这种作用有关。 但其临床镇痛作用仍待研究［2］。 1.4 对体温的影响一般认为文拉法辛不升高正常体温，但能拮抗利血平(reserpine)和 阿扑吗啡(apomorphine)对小鼠的降温作用［3］。但最近有文拉法辛治疗引起情感性精 神障碍患者发热感的报道［4］，并认为文拉法辛在 50～75mg/d 的剂量时仍有拟 NE 能 作用，故可增加糖原及脂肪的分解，从而增强代谢引起全身发热感。 1.5 心血管系统有报道称该药可使血压轻度升高，特别是舒张压，可能与文拉法辛阻 断 NE 的重吸收有关。 2 临床应用 2.1 治疗抑郁症多项比较文拉法辛疗效的研究均认为本品治疗抑郁症疗效显著。 Thase 收集了关于文拉法辛与 5-HT 再摄取抑制剂(SSRIs)比较的 8 项双盲对照研究，其 中 4 项研究还与安慰剂进行对照［5］。8 项研究共有 2045 例研究对象，其中服用文拉法 辛者 85l 例，SSRIs 者 748 例，安慰药者 446 例。经分析后得出文拉法辛组的痊愈率高于 SSRIs 组，痊愈出现更快，且该结论与患者年龄性别无关。金卫东等［6］对 16 项对照研 究的 Meta 分析亦得出相似的结论。与 TCA 相比，因文拉法辛较叔胺类三环抗抑郁药的不 良反应少，故可耐受剂量范围更大，缓解率亦更高［7］。此外，本品起效时间与米氮平 差异无显著性；转躁率与舍曲林相似［8］。另有人运用药物经济学成本-效果分析方法比 较氟西汀、文拉法辛和阿米替林的经济效果后认为文拉法辛成本-效果比较低，显效率较高 ［9］。 有研究表明该药对某些特定抑郁人群仍有效。本品可升高 5-HT 能，故具抗焦虑和抑 郁双向作用［10］，亦能治疗产后抑郁。开放研究表明，文拉法辛治疗 l5 例产后抑郁症 病人，8 周时 80％的病人缓解［11］。此外，对老年人的激越性或焦虑性抑郁的 8 周缓 解率比 SSRIs 高（40%～55%;31％～37%，P＜0.05）是由。亦可治疗卒中后抑郁状态，利 于患者神经功能康复，提高生活能力，减少并发症［12］。亦有报道本品可用于难治性抑 郁。 2.2 治疗焦虑症文拉法辛的抗焦虑效应较复杂，具有拟 5-HT 能，可激动 5-HT1A 受 体抗焦虑，亦可激动 5-HT2A 受体致焦虑［10］。故其作用取决于患者对哪种受体更敏感， 以抗焦虑为多见。Kate 等汇集了 5 项安慰剂对照试验，发现文拉法辛治疗广泛性焦虑症的 有效率比安慰剂高，在年轻人为 67％:44％(P＜0.001)，在年长成人为 66％:41％(P＜ 0.001)［13］。 2.3 治疗强迫症文拉法辛治疗强迫症有效。包括曾经接受过选择性 5-HT 再摄取抑制剂 治疗无效的患者。其抗强迫作用可能有两方面原因：一是强迫症发生的机制是脑内 5-HT 功能低下，而去甲肾上腺素的功能变化对之有影响；二是文拉法辛可同时抑制 5-HT 和 NE 的再摄取。可同时调整二者的功能变化。故其抗强迫效应稍胜 SSRIs。研究表明，一种 SSRI 足量足程(12 周)无效后，可换成另一种 SSRI、氯丙咪嗪或文拉法辛，有效率可升至 70％［14］。 2.4 治疗社交恐怖症社交恐怖症的 5-HT1A 受体正常，5-HT2 受体超敏［15］。文拉 法辛可能是通过增加 5-HT 能，使 5-HT2 受体逐渐脱敏，达到治疗社交恐怖症的目的。但 因本品有拟 NE 能，故目前不作为该症的一线药物。 2.5 治疗创伤后应激障碍精神创伤激活蓝斑引起创伤后应激障碍(PTSD)症状。文拉法 辛通过阻断 5-HT 回吸收而激活背部缝际-蓝斑 5-HT 通路，抑制蓝斑 NE 能，改善 PTSD 症状。对照试验表明，PTSD 患者用文拉法辛缓释剂、舍曲林和安慰剂治疗 l2 周后发现， 文拉法辛的 PTSD 缓解率比安慰剂为高(31％:20％，P＜0.05)，而舍曲林的缓解率与安慰 剂无差异(24％:20％P＞0.05)［16］，提示文拉法辛治疗 PTSD 比舍曲林有效。 2.6 治疗青少年儿童注意缺陷研究表明，ADHD 患者脑内 NE 能递质功能不足，至少 是 NE 能递质功能不平衡。故文拉法辛通过 NE 能作用可改善注意力，通过 5-HT 能作用可 抑制冲动行为，能消除多动症的各种症状。王文强等［17］报道有效率可达 80.9%。 2.7 治疗精神分裂症近年来有多个研究表明文拉法辛与抗精神病药合用治疗精神分裂 症有较好疗效，包括辅助治疗精神分裂症阴性症状。高存友等［18］的研究还发现该药有 益于改善慢性精神分裂症患者的认知障碍。 此外，有研究得出，本品结合低热卡饮食可显著降低抗精神病药引起的肥胖；延长释 放本药 75mg/d 的剂量可改善绝经后妇女的潮热；长效制剂可缓解糖尿病人的神经性疼痛。 本品亦可用于戒酒，目前已成为新一代治疗酒依赖的抗抑郁剂。 3 不良反应 该药不良反应较轻微。约有 1/3 的用药者会发生恶心，特别在开始用药的几周中较为 明显。一数据库收集 3000 例所做的分析表明，该药所致头晕、头痛、睡眠障碍、口干和