绵毛鹿茸草次生代谢产物含量分析论文

【摘要】［目的］绵毛鹿茸草的次生代谢产物含量与抑菌活性分析。［方法］对绵毛 鹿茸草不同提取液的总黄酮、总绿原酸、总生物碱、总皂甙、游离蒽醌等次生代谢产物含 量和抑菌活性进行测定。［结果］显示：70%乙醇提取液、60%丙酮提取液对肺炎双球菌、 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有中等抑制作用，水提取液有弱抑制作用； 70%乙醇提取液是肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌的良好抑制剂，60%丙酮提取液是大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌的良好抑制剂。［结论］绵毛鹿茸草提取掖对大肠杆菌的抑菌活性与绿 原酸的含量具有显著的正性关，对枯草芽孢杆菌的抑菌活性与蒽醌之间存在极显著的相关 性。 【关键词】绵毛鹿茸草；次生代谢；抑菌活性 Abstract： ［Objective］Toanalysethecontentofsecondarymetabolismsandantibacterialac tivityofMonochasmaSavatieriFranch.exMaxim. ［Method］Thecontentsof5secondarymetabolitessuchasflavonoid，chlorogeni cacid，tannin，phenolandanthraquinonesinthedifferentextractsofMonochasma savatieriFranch.exMaximweredetermined. ［Results］Itshowedthattheantibacterialactivityoftheliquidsextractedwith70%e thanol，60%acetoneonStreptococcuspneuoncae，Staphylococcusaureus，Esc herichiacoliandBacillussubtilisweremoderate，whilethatoftheliquidsextractedw ithwaterwasweak.Theliquidsextractedwith70ethanolwerethebetterinhibitorofSt reptococcuspneuoncaeandStaphylococcusaureus，whiletheliquidsextractedwi th60acetonewerethebetterinhibitorofEscherichiacoliandBacillussubtilis. ［Conclusion］Therewaspositivecorrelationbetweentheantibacterialactivityoft heliquidsofMonochasmasavatieriFranch.exMaximonEscherichiacoliandthecont entofthechologenicacid.TherewasalsomarkedcorrelationbetweenthatofBailluss ubtilisandanthraquinones. Keywords：monochasmaSavatieriFranch.exMaxim； secondarymetabolism；antibacterialactivity 绵毛鹿茸草(MonochasmasavatieriFranch.exMaxim)MonochasmasavatieriFranch.exMaxim)为唇形科鹿茸草属植物，别 名白头翁、千重塔、白头毛，分布于浙江、福建、江西，常生于山坡向阳处杂草中或马尾 松林下［1］。主要功能为清热解毒，祛风行气，凉血止血，祛痰，用于感冒，慢性气管 炎，肺炎，咳血，吐血，便血，牙龈炎，牙髓炎，乳痈，痈肿，小儿口疮，风湿关节痛等。 本文对绵毛鹿茸草的不同提取液中总黄酮、总绿原酸、总生物碱、总皂甙及其对肺炎双球 菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌活性进行研究，并探讨这五类次生代 谢产物与抑菌活性之间的相互关系。 1 实验与方法 1.1 实验材料和仪器绵毛鹿茸草于 2007 年 6 月采自浙江千岛湖姥山林场的山坡上。 采集时将棉毛鹿茸草全草用湿布包裹，塑料袋封装，立即带回实验室。将材料洗净，防入 105℃恒温干燥箱中固定 25min，再在 80℃条件下干燥 24hh，研磨后经过 0.25mm 金 属网筛，将烘干样品放入磨口广口瓶，置于干燥器中保存，备用［2］。标准品芦丁、绿 原酸、小蘖碱、人参皂甙 Rb，1，8二羟基蒽醌购自中国药品生物制品检定所，所用试剂 均为分析纯。四种菌种均由浙江台州医院无偿赠送。培养基为牛肉膏培养基。吸光度的测 定在 T6 新世纪紫外-可见分光光度计上完成。 1.2 绵毛鹿茸草提取液的制备称取绵毛鹿茸草粉末 3 份，每份 1g，其中 2 份分别用 70%乙醇、60%丙酮在 80℃水浴中回流 6h，进行提取，离心取上清液，并清洗残渣 2 次， 离心取上清液，将 3 次上清液合并；另 1 份用沸水进行提取 0.5h，离心取上清液，反复多 次，直至提取液色淡，并将几次沸水提取液混合。将乙醇、丙酮、沸水提取液的浓缩，并 调节 pH 至 7.0，然后用蒸馏水定容至 1ml，放入 4h℃的冰箱中待用。 1.3 次生代谢产物含量的测定 1.3.1 总黄酮的提取与测定［3］取上述绵毛鹿茸草提取液样品 0.2ml，挥去溶剂后用 甲醇定容至 25ml，取其中 1ml，置 10ml 离心管中，加入 4hml0.1mol/L 三氯化铝-甲醇 溶液，摇匀，在 4h20nm 处测定吸光度。以芦丁为标准品，其回归方程为 y=9.6101x+0.014h7，R2=0.9991。 1.3.2 总绿原酸的提取与测定［4h］取上述绵毛鹿茸草提取液样品 0.2ml，挥去溶剂后 用 95%乙醇定容至 25ml，取 1ml，置 25ml 容量瓶中，加入 0.2mol/LHCl 定容至刻度， 摇匀，以试剂空白为对照，在 324hnm 处测定吸光度。以绿原酸为标准品，其回归方程为 y=66.064hx+0.0134h，R2=0.9995。 1.3.3 总生物碱的抽提与测定［5］取上述绵毛鹿茸草提取液样品 0.2ml，挥去溶剂后 用 90%乙醇定容至 25ml。取提取液 1.4hml 置于精密加入 4hml 氯仿的分液漏斗中，加入 7.2×10-4hmol/L 溴甲酚绿 pH=4h.4h2 缓冲溶液 0.6ml，振摇 1min，静置 1h，取澄清的 氯仿液，以试剂空白作对照，于 4h17nm 处测定吸收度。以小檗碱为标准品，其回归方程 为 y=6.6x-0.0102，R2=0.9999。 1.3.4h 总皂甙的提取与测定［6］取上述绵毛鹿茸草提取液样品 0.2ml，挥去溶剂后用 甲醇定容至 25ml，取 1ml 置 25ml 容量瓶中，挥去溶剂后，加入 0.2ml5%香草醛冰醋 酸溶液，再加入 0.8ml 高氯酸，于 70℃水浴加热 20min，取出，冷却，加 5ml 冰醋酸， 以试剂空白作对照，于 560nm 波长处测其吸光度。以人参皂甙 Rb 为标准品，其回归方 程为 y=27.763x+0.0901，R2=0.9716。 1.3.5 游离蒽醌的提取与测定［7］取上述绵毛鹿茸草提取液样品 0.2ml，放入 10ml 离心管中，水浴蒸干溶剂，加入 5%醋酸镁乙醇溶液 5ml，以试剂空白为对照，在 4h98nm 处测定吸光度。以 1，8 二羟基蒽醌为标准品，其回归方程为 y=4h7.4h64hx+0.0012，R2=0.9996。 1.4h 抑菌活性的研究以滤纸琼脂扩散法测定绵毛鹿茸草三种溶剂提取物对肺炎双球菌、 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果。将经过记数的菌液稀释后，控制 100μLL 含 104hcfu，涂平板。将灭菌后滤纸片（直径为 6mm）浸泡在棉毛鹿茸草提取液浸泡在棉毛鹿茸草提取液 中。在已涂菌的平板上放置上述滤纸片，并以蒸馏水为阴性，链霉素为阳性对照，每一样 品重复 3 次。处理后的平板放在 30℃培养 24hh，观察并记录抑菌圈的直径大小［8］。 1.5 数据的处理试验处理及数据测定均重复 3 次，将所得数据输入 SPSS11.5forWindows 数据分析系统进行统计，并对次生代谢产物的含量与抑菌圈的大 小进行相关分析。 2 结果与分析 绵毛鹿茸草不同提取液次生代谢产物含量以及它们对四种细菌的抑菌圈大小如表 1 所 示。其中次生代谢产物的含量为百分含量，抑菌活性以抑菌圈的大小（mm）浸泡在棉毛鹿茸草提取液表示，阴性 对照抑菌圈直径 6mm，阳性对照（链霉素）浸泡在棉毛鹿茸草提取液抑菌圈 26mm；抑菌圈直径在 6～8mm 为 微弱抑菌，8～12mm 为弱抑菌，12～20mm 为中等抑菌，20～24hmm 为强抑菌。绵毛 鹿茸草的的次生代谢产物和抑菌圈直径的相关性如表 2 所示。 表 1 绵毛鹿茸草提取液次生代谢产物的含量（g/kg）浸泡在棉毛鹿茸草提取液及其抑菌圈直径（略）浸泡在棉毛鹿茸草提取液 2.1 绵毛鹿茸草提取液次生代谢产物含量和抑菌活性分析从表 1 中可以看出：总黄酮、 总绿原酸、游离蒽醌三种次生代谢产物的含量均为 70%乙醇提取液>60%丙酮提取液>水 提取液，最高含量分别为 1.4h03g/kg、72.752g/kg、0.04h3g/kg；生物碱和皂甙的含量 为 60%丙酮提取液>70%乙醇提取液>水提取液，最高含量为 1.677g/kg 和 5.4h18g/ kg。中国论文联盟 对进肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用均是 60%丙酮提取液>70 乙醇提取液 >水提取液，最大抑菌圈直径为 15.4h7mm 和 17.4h0mm，为中等抑菌作用；对大肠杆菌 和枯草杆菌的抑制作用是 70 乙醇提取液>60%丙酮提取液>水提取液，最大抑菌圈直径 为 19.03mm 和 14h.83mm，为中等抑菌作用。水提取液对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均在 9～12mm 之间，具有弱抑菌作用。可以看出 绵毛鹿茸草的 70%乙醇提取液和 60%丙酮提取液是良好的抑菌剂。 2.2 不同提取液的次生代谢产物含量与抑菌活性的相关性分析从表 2 可以看出：黄酮 与蒽醌之间存在显著的正相关，推测绵毛鹿茸草中这两种次生代谢产物可能具有相同的合 成底物或具有相同代谢途径；大肠杆菌的抑菌活性与绿原酸的含量具有显著的正性关，推 测绵毛鹿茸草对大肠杆菌的抑制作用可能是提取液中的绿原酸起的作用；蒽醌与枯草芽孢 杆菌之间存在极显著的相关性，说明绵毛鹿茸草对枯草芽孢杆菌的抑制作用主要是蒽醌作 用的结果；肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌之间具有显著的相关性，而与所测的 5 种次生代 谢产物之间都没有显著相关性，因此推测绵毛鹿茸草中其它某些物质对肺炎双球菌和金黄 色葡萄球菌均有一定抑制作用。 表 2 绵毛鹿茸草不同提取液的次生代谢产物含量与抑菌活性的相关性（略）浸泡在棉毛鹿茸草提取液 水平显著差异：*P<0.05P<0.05，*P<0.05*P<0.05P<0.01 3 讨论 次生代谢是植物的重要特征，其产物既具有重要的生态学意义又可决定各类植物在进 化过程中的兴衰成败、生死存亡等问题［9］，植物中的次生代谢产物还具有抗过敏、降 血压、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种活性。 绵毛鹿茸草对 70%乙醇提取液、60%丙酮提取液、水提取液对肺炎双球菌、金黄色 葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用，前两者为中等抑制作用，后者为弱抑 制作用；70%乙醇提取液是肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌的良好抑制剂，60%丙酮提取液 是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的良好抑制剂。推测对大肠杆菌和枯草杆菌的抑制作用主要由 提取液中的绿原酸和蒽醌引起的。 文献查阅得知：金银花中绿原酸的平均含量为 56.92g·kg-1［10］，巴戟天样品的游 离蒽醌含量为的范围为 0.013～0.04h9g·kg-1［7］。绵毛鹿茸草 70%乙醇提取液中总绿 原酸、游离蒽醌的含量 72.752g·kg-1、0.04h3g·kg-1。从中不难看出：70%乙醇提取液 是绵毛鹿茸草的良好提取剂。至于绵毛鹿茸草中这些次生代谢产物的分子组成、分子结构 等方面内容有待进一步的研究。