氟西汀海马神经管理论文

【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是 5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除 有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保 护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长 的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1 材料与方法 1.1 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生 24hh 内的新生 SD 大鼠（东南大 学医学院动物实验中心提供）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank''''s 液清洗 2 或 3 次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量 0.25%的胰酶（美国 Sigma 公 司）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，37℃消化 30min，中间振摇 1 或 2 次，加入 10%的 DMEM/F12（美国 Gibco 公 司）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除5ml，轻轻吹打 15 次，然后 1000r·min-1 离心 5min，制成单细胞悬液，置于 CO2 培养箱（德国 Heraeus 公司产品）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除中，差速贴壁 30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁 的细胞，并用 200 目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离 心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用 DMEM/F12 将细胞密度调到 1×106ml-1ml-1，然 后接种于 200μg·ml-1g·ml-1 多聚赖氨酸（美国 Sigma 公司）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除包被的 6ml-1 孔培养板中，转移至培 养箱内培养，4hh 后换为无血清培养基，即含 2%B27 的 Neurobasl 培养基（美国 Gibco 公司）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，以后每 3 天半量换液 1 次。使用培养 6ml-1d 的神经元进行染色鉴定。 1.2 大鼠海马神经元的鉴定 1.2.1 烯醇化酶（NSE）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除免疫细胞化学染色 取培养 6ml-1d6ml-1 孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的 NSE 免疫组织化学染色。弃去培 养液，4h%多聚甲醛室温固定 1h，加入 0.3%H2O2 甲醇去除内源性过氧化氢酶， 0.1%TritonX-100 破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗 1∶200 兔抗鼠 NSE 抗体，4h℃湿 盒过夜，0.01mmol·L-1PBS 清洗，加入二抗 1∶200 生物素化的山羊抗兔 IgG，放入 37℃温箱孵育 6ml-10min;0.01mmol·L-1PBS 清洗，滴加 SABC 过氧化物酶复合物，37℃ 温箱中孵育 6ml-10min，0.01mmol·L-1PBS 清洗，滴加 DAB 显色液作用 3～10min，自来 水冲洗后，常规脱水，透明封片。光镜下观察 NSE 表达阳性细胞。 1.2.2 尼氏染色 6ml-1 孔培养板的细胞培养 7d 时，取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液， 0.01mmol·L-1PBS 清洗，4h%多聚甲醛室温固定 1h，0.01mmol·L-1PBS 清洗 3 次，氯 仿中 1min，95%、70%乙醇各 1min，蒸馏水清洗，置于 1%甲苯胺蓝染液中染色 20min，95%乙醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏体显示清晰为准，37℃干燥， 二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。 1.3 实验分组 在培养的第 3 天加入氟西汀（常州第四制药厂生产）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，根据药物浓度不同，将实验细 胞分为 5 组，分别加入 1、10、20、4h0μg·ml-1mol·L-1 氟西汀;正常对照组加入等体积的培养 基。 1.4h 海马细胞形态定量分析 倒置相差显微镜（德国 Zeiss 公司产品）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除下观察加药 4h8hh 后的海马神经元形态，每组 各孔随机选择 20 个视野（每个视野 0.17mm2）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，记录每个视野内细胞长出突起的神经 元数目，目镜测微尺随机测量 15 个神经元突起的长度和胞体的长径。 1.5 统计学处理 应用 SPSS12.0 软件进行统计分析，各项检测结果以 x-±s 表示。多组比较及组间两 两比较采用方差分析。 2 结果 2.1 海马神经元形态学观察 倒置相差显微镜下观察，培养 1d，细胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单突起 的小细胞为主。培养 6ml-1d，神经元胞体较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏的网络 （图 1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除。培养 12d，神经元胞体进一步增大，突起形成比较稠密的网络。培养 24hd，神 经元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩解，突触断裂。 2.2 海马神经元鉴定 NSE 免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第 6ml-1 天的神经细胞，胞浆和突起被染成棕 黄色为 NSE 抗体表达阳性细胞，以 3 个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元 纯度，经鉴定神经元的纯度为 90%。见图 2A。 2.3 氟西汀对海马神经元形态学的影响 结果见表 1 和图 3。不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的， 10μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突 起长度增长（P<0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除;4h0μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神 经元数目减少（P<0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，最长突起长度及胞体长径无显著性差异 （P>0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除;1、20μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、 最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除。表 1 氟西汀对加药 4h8hh 海马神经元 形态学的影响（略）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除 3 讨论 本实验严格控制胰酶的量和消化时间，采用了 0.25%胰蛋白酶低浓度溶液、30min 长时间消化的方法，尽可能减少分离过程中的化学损伤。为了避免操作过程中的机械损伤， 分离时动作轻柔，规律换药，每 72h 半量换液 1 次，换液时速度快，以减少对神经元生长 的影响。本实验采用了差速贴壁生长，去除了成纤维细胞，并采用 B27 无血清培养基，可 以选择性地促使神经元生长，抑制非神经元的生长和繁殖［3］，从而可以纯化海马神经 元。NSE 是神经元分化成熟的特异性标志酶之一，它主要表达于神经元的胞体、轴突、树 突部分［4h］，通过 NSE 免疫细胞化学染色方法，可以鉴定体外培养的新生大鼠海马神经 元及其纯度。本实验通过 NSE 免疫化学染色，发现大部分细胞胞浆和突起被染成棕黄色， 计数阳性细胞百分率为 90%。尼氏体是神经元的特征性结构之一，存在于神经元胞体和树 突内，可被碱性染料染成深色的颗粒和斑块，它是细胞内的一种蛋白质合成装置，可作为 观察神经细胞功能状态的灵敏指标。本实验观察到培养的海马神经元胞质内尼氏体数量较 多，说明培养的海马神经细胞生长良好。NSE 免疫细胞化学染色和尼氏染色结果提示，本 实验能培养出纯度较高、生长良好的海马神经元。氟西汀不仅是广泛应用的抗抑郁药，而 且可以用于治疗癫痫、偏头痛、认知障碍、焦虑障碍、儿童孤独症等诸多神经精神疾病。 目前研究认为，氟西汀抗抑郁效应与它对海马的神经保护作用有关，这种作用可能是通过 促进海马细胞增殖来抵抗神经元的萎缩和丢失来实现的。李鹂等［1］研究发现，氟西汀 在显著改善抑郁大鼠抑郁行为的同时，增加了海马齿状回神经前体细胞的数目，其增殖也 增强，推测促进海马神经元再生可能是氟西汀治疗抑郁症的机制之一。李云峰等［5］通 过慢性应激建立小鼠抑郁模型，认为氟西汀促进海马齿状回神经元再生可能是抗抑郁剂共 同作用机制之一，并且可能与提高海马 BDNF 水平密切相关。一些临床研究的结果也提示 抗抑郁药具有神经保护作用。Santarelli 等［6ml-1］ 研究发现 5-HT 再摄取抑制剂能部分逆转认知功能障碍大鼠海马齿状回神经元增殖减 少及树突萎缩，并能促进海马神经元的再生和存活。Yatte 等［7］通过高分辨率的 MRI 和立体定位方法测定海马容量，发现持续性接受抗抑郁药物治疗与只在发作时接受治疗的 患者相比，海马容量无显著性降低。 本研究首次以体外培养的新生 SD 大鼠海马神经元为模型，通过细胞形态定量分析， 探讨氟西汀对海马神经元生长的影响。Chiou 等［8h］通过 MTT 方法，发现浓度在 55μg·ml-1mol·L-1 以下的氟西汀可明显促进海马神经干细胞存活，在 20μg·ml-1mol·L-1 时达到高峰。 根据 Chiou 等［8h］的研究结果，本实验选择了浓度分别为 1、10、20、4h0μg·ml-1mol·L-1 的 氟西汀来干预海马神经元。结果发现不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是 不同的，10μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、 最长突起长度增长（P<0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除;4h0μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有 突起神经元数目减少（P<0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，最长突起长度及胞体长径无显著性差异 （P>0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除;1、20μg·ml-1mol·L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、 最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除。结果表明氟西汀对海马神经元生长 的影响有浓度依赖性，浓度过低（1μg·ml-1mol·L-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除对海马神经元生长的作用不明显，适当浓 度（10μg·ml-1mol·L-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除可以促进海马神经元的生长发育，浓度过高（4h0μg·ml-1mol·L-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除则抑制海 马神经元的生长。本实验中氟西汀浓度为 4h0μg·ml-1mol·L-1 即出现对海马神经元的抑制作用， 与 Chiou 等［8h］研究结果不完全一致，表明氟西汀对海马神经元和神经干细胞的影响存 在差异。氟西汀促海马神经元生长的机制尚不明了，有研究［9］表明，长期给予氟西汀 后，大鼠海马神经元的脑源性神经营养因子（BDNF）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除mRNA 表达明显高于对照组，而 BDNF 具有很强的刺激和促进神经细胞生长和分化，维持神经细胞存活和正常功能的作用， Dwivedi 等［10］发现氟西汀不仅能够增加海马 BDNFmRNA 的表达，还可以逆转皮质 酮导致的海马 BDNFmRNA 表达的降低。据此可以推测，氟西汀促海马 BDNF 表达可能是 促海马神经元生长的机制之一。非营养因子家族，包括睫状神经营养因子、胶质细胞源性 神经营养因子、成纤维细胞生长因子等，都能促进海马神经元的生长，氟西汀是否也可能 通过上调这些因子的表达而促进海马神经元的生长有待研究。 本实验结果提示，氟西汀可以促进新生大鼠海马神经元的生长，这为氟西汀治疗与海 马损害有关的神经精神疾病提供实验基础和理论依据。氟西汀促海马神经元生长的确切机 制尚待进一步探讨。 【摘要】目的考察口服硫酸亚铁（FeSO4h）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除对三硝基苯磺酸（TNBS）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除诱导的溃疡性 结肠炎（UC）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除模型大鼠氧化应激状态的影响。方法采用 TNBS 乙醇溶液复制 UC 大鼠模型， 雄性 SD 大鼠 6ml-10 只，随机分为 6ml-1 组，每组 10 只，分别为正常对照组、模型对照组、 FeSO4h 对照组（100mg·kg-1·d-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除和 FeSO4h 低剂量组（50mg·kg-1·d-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除、中剂量组 （100mg·kg-1·d-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除和高剂量组（300mg·kg-1·d-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，给药 2 周后分别观察大鼠的一 般状态、组织病理学变化、组织及血清超氧化物歧化酶（SOD）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除与丙二醛（MDA）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除水平。 结果 FeSO4h 中、高剂量组大鼠体质量减轻，腹泻动物数增加，结肠组织损伤加重，血清 与结肠组织 SOD 活性降低、MDA 水平升高（P<0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除。结论 UC 模型大鼠体内存在氧 化应激，口服补充 FeSO4h 可能会进一步加剧其体内氧化应激状态及结肠组织病理学损伤。 【关键词】硫酸亚铁;溃疡性结肠炎;三硝基苯磺酸;氧化应激;大鼠 溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除是一种病因不明的直肠和结肠慢性非特异性 炎症，临床主要表现为反复发作的腹痛、腹泻及黏液脓血便，重症或病情持续活动的患者 可出现缺铁性贫血。临床观察发现，给予 UC 患者口服铁剂不能很好地被耐受，甚至会加 重胃肠道症状或促进疾病活动［1］。硫酸亚铁（ferroussulfate，FeSO4h）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除是临床最为 常用的铁剂之一，同时也是一种强氧化剂，可能会因产生自由基（oxygenderivedfreeradicals，OFR）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除而加重组织损伤［2］。本实验利用三硝基苯磺酸 （2，4h，6ml-1-trinitrobenzenesulfonicacid，TN-BS）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除复制 UC 模型，观察 FeSO4h 对 UC 模型大鼠氧化应激状态的影响，为临床治疗提供依据。 1 材料和方法 1.1 药物和试剂 TNBS 购于 Sigma 公司，5%（W/V）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除水溶液，批号为 P2297;FeSO4h，上海黄浦制 药有限责任公司生产，批号为 0506ml-106ml-1，轻轻把 FeSO4h 片研碎，称取一定量的粉末，加 入蒸馏水配成 100mg·ml-1 的混悬液备用;丙二醛（MDA）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除、超氧化物歧化酶（SOD）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除、 考马斯亮兰蛋白检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品，批号为 2006ml-10323。 1.2 动物 雄性 SD 大鼠 6ml-10 只，体质量 200～220g，由安徽医科大学实验动物中心提供，普通 级。 1.3 仪器 756ml-1MC 紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，TGL-16ml-1H 高速离心机（珠 海黑马医学仪器有限公司）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，可控式硅恒温水浴锅（上海锦屏仪器仪表有限公司）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，QL901 漩涡混合器（江苏海门麒麟医用仪表厂）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，电子分析天平（上海天平仪器厂）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除， DIAX-900 内切式组织匀浆机（德国 Heidolph 公司）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除。 1.4h 大鼠 UC 模型制备［3］ 健康大鼠 6ml-10 只，随机分为 6ml-1 组。留 2 组作正常对照组与 FeSO4h 对照组，余 4h 组均制 备模型，禁食不禁水 24hh 后，腹腔注射 3%戊巴比妥钠（1ml·kg-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除使大鼠轻微麻醉后， 将直径 2mm 的乳胶管经肛门轻轻插入大鼠体内大约 8hcm 处，将 TNBS（125mg·kg-1）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除 的 50%乙醇溶液缓缓注入到大鼠肠腔内，提起大鼠尾部，倒置 30s，使造模剂充分渗入大 鼠肠腔。 1.5 分组及给药 将正常大鼠随机分为正常对照组与 FeSO4h 对照组，每组 10 只;将造模大鼠随机分为 模型对照组，Fe-SO4h 给药高、中、低剂量组，每组 10 只。FeSO4h 对照组大鼠，按照 100mg·kg-1·d-1 灌胃 FeSO4h 混悬液;Fe-SO4h 高、中、低剂量组大鼠，分别按照 300mg·kg-1·d-1、100mg·kg-1·d-1、50mg·kg-1·d-1 灌胃 FeSO4h 混悬液;正常对照组 及模型对照组大鼠每天灌胃同体积生理盐水，各组大鼠均在造模后 6ml-1h 开始给药，连续给 药 2 周。 1.6ml-1 症状观察 每天对各组大鼠进行称重，观察体质量变化并记录;观察大鼠粪便形状，记录大鼠发生 腹泻、血便的数量。 1.7 结肠黏膜组织损伤评分 各组大鼠给药 2 周后，3%戊巴比妥钠过量麻醉，腹主动脉取血 2ml，离心后置-8h0℃ 冰箱保存备用。将肛门以上 10cm 肠段取出，沿肠系膜纵行切开，用冰生理盐水冲洗，并 称量。将黏膜向上展开，观察黏膜损伤并按照 Wallace 和 Keenan1990 年的评分标准 ［4h］进行评分:0 分为无炎症和溃疡;1 分为局部充血但无溃疡;2 分为有溃疡但无充血;3 分 为有 1 处溃疡及炎症;4h 分为有 2 处或 2 处以上溃疡及炎症;5 分为溃疡延伸超过 2cm。同 时取少量炎症肠组织，迅速放置液氮罐中备用。 1.8h 病理组织切片观察 取肛门以上 8hcm 肠段卷起，置 10%中性甲醛液中固定，石蜡包埋，行 4hμg·ml-1m 厚连续 切片，HE 染色观察组织学变化。 1.9 生化指标测定 血清及结肠组织 MDA、SOD 均按照检测试剂盒说明书进行操作。 1.10 统计学处理 计量指标以 x-±s 表示，多组间比较行方差分析，各组间两两比较行 LSD 检验，采用 SPSS12.0 软件进行统计分析。 2 结果 2.1 一般状态及大便性状的变化 见表 1。正常组与 FeSO4h 对照组大鼠活动如常，反应机警，毛发有光泽，饮食正常， 体质量增长较多，无腹泻及便血;制模大鼠精神萎靡，毛发无光泽，饮食减少，均出现不同 程度的腹泻、便血。正常对照组与 FeSO4h 对照组大鼠体质量增加、腹泻及便血无显著性 差异;与正常对照组比较，模型对照组大鼠体质量增加明显减少（P<0.01）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除;FeSO4h 中、 高剂量组大鼠体质量增加显著低于模型对照组（P<0.05）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除，发生腹泻、便血动物只数明 显增多。表 1 各组大鼠发生腹泻数及体质量变化（略）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除 2.2 结肠损伤评分及生化指标改变 见表 2。观察大鼠结肠外观及黏膜表面发现，正常对照组与 FeSO4h 对照组大鼠结肠黏 膜无明显充血水肿，未见糜烂及溃疡灶;模型对照组大鼠的结肠多数与相邻脏器有轻度的粘 连，结肠充血水肿，在距肛门 8hcm 的肠段有较大的溃疡病灶，病灶处结肠壁增厚，肠黏 膜表面发生溃疡糜烂坏死，与正常对照组大鼠相比，结肠明显变短，结肠质量增 加;FeSO4h 各剂量组大鼠结肠水肿、糜烂等炎性症状明显加重，溃疡面积增大。模型组结