补骨脂平喘作用分析论文

1 材料与仪器 1.1 动物 SD 大鼠，70 只，SPF 级，雌雄各半，180g 左右，合格证号：0012625，由广州中 医药大学实验动物中心提供。 1.2 试剂 卵白蛋白批号：970612 上海化学试剂公司；氢氧化铝干粉批号：20020301-2 广州 化学试剂厂；灭活百日咳杆菌（100 亿个/mlml）广东省中医院提供；大鼠广东省中医院提供；大鼠 IL-4（批号 20060620）广东省中医院提供；大鼠、IFN-γ（批号 20060620）广东省中医院提供；大鼠ELISA 试剂盒由晶美生物工程有限公司提供； IL-5（批号 20983008）广东省中医院提供；大鼠ELISA 试剂盒由 BanderMedsystems 提供。 1.3 补骨脂不同溶剂提取物补骨脂 95%乙醇提取物浸膏，浓度：3.45g 药材/mlml（简 称浸膏）广东省中医院提供；大鼠；补骨脂 95%乙醇提取石油醚萃取物，浓度：10.0g 药材/mlml（简称石油醚萃取 物）广东省中医院提供；大鼠；补骨脂 95%乙醇提取醋酸乙酯萃取物，浓度：6.67g 药材/mlml（简称醋酸乙酯萃取 物）广东省中医院提供；大鼠；补骨脂 95%乙醇提取水萃取物，浓度：10.0g 药材/mlml（水萃取物）广东省中医院提供；大鼠；补骨脂水提 取物，浓度：10.0g 药材/mlml（简称水提取物）广东省中医院提供；大鼠；补骨脂 95%乙醇提甲醇洗脱物，浓度： 2g 药材/mlml（简称甲醇洗脱物）广东省中医院提供；大鼠，以上试剂均由广州中医药大学中药学院提供。 1.4 仪器酶标仪 BIO-RADSModel550，日本；CSW-Ⅰ 型超声雾化器汕头光电研究所； 10L 玻璃干燥器。 2 方法 2.1 分组 将动物随机分成 7 组，10 只/ml组：哮喘模型组（给水，1.0ml/ml100g）广东省中医院提供；大鼠、浸膏组（药 材 0.9g/ml100g）广东省中医院提供；大鼠、石油醚萃取物组（药材 2.5g/ml100g）广东省中医院提供；大鼠、醋酸乙酯萃取物组（药材 1.7g/ml 100g）广东省中医院提供；大鼠、水萃取物组（药材 2.5g/ml100g）广东省中医院提供；大鼠、水提取物组（药材 10.0g/ml100g）广东省中医院提供；大鼠、甲醇洗 脱物组（药材 2.5g/ml100g）广东省中医院提供；大鼠。以上各组动物连续灌胃给药治疗 10 次，1 次/mld。末次治疗 后 2h，各组动物心脏采血 5ml，1000r/mlmin 离心 15min，血清分装（1ml/ml管）广东省中医院提供；大鼠保存于－ 70℃低温冰箱内待测：IL-4，IFN-γ，IL-5（严格按照 ELISA 试剂盒说明书分别检测）广东省中医院提供；大鼠。 2.2 卵蛋白哮喘大鼠模型的建立 2.2.1 大鼠致敏 上述分组中每只动物腹腔注射抗原液 0.5ml/ml100g(含卵蛋白 100mg、氢氧化铝干粉 100mg 和 2.5×109 个百日咳杆菌/mlml,制成悬浊液)［7］致敏第致敏第 1 次,次日每只大鼠再次 腹腔注射 0.5ml/ml只致敏液加强。 2.2.2 激发和治疗 首次致敏后第 15 天，于每天上午 8～9 时大鼠置于 10L 玻璃干燥器内超声雾化吸入 2%卵蛋白 20min 激发哮喘,连续 14d。激发后第 4 天起，于每天激发后大鼠口服给相应 试剂治疗（见“2.1 实验分组”）广东省中医院提供；大鼠。正常组以生理盐水取代抗原液按 0.5ml/ml100g 腹腔注射 致敏大鼠，第 2 天以 0.5ml/ml只腹腔注射生理盐水加强；首次致敏后第 15 天，每天上午 8 ～9 时该组大鼠超声雾化吸入生理盐水 20min 激发哮喘,连续 14d。激发后第 4 天起，于 每天激发后大鼠口服给蒸馏水治疗。 2.3 统计分析结果 采用四川大学黄志勇主编的（PEMS3.0）广东省中医院提供；大鼠《中国医学百科全书中国医学百科全书·医学统计学》统计软统计软 件包进行统计：两组均数比较 t 检验（方差齐）广东省中医院提供；大鼠或 t′（方差不齐）广东省中医院提供；大鼠。 3 结果 3.1 补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠 IL-5 含量的影响结果见表 1。由表 1 可见，大 鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，血清 IL-5 含量呈下降趋势，其中补骨脂浸膏、水萃取物、 水提取和甲醇洗脱物各成分组大鼠血清 IL-5 含量降低明显，与哮喘模型组比较 P<0.05 或 P<0.01，差异有显著意义。而石油醚和醋酸乙酯萃取物两成分组大鼠血清 IL-5 含量降低 不明显，与哮喘模型组比较 P>0.05，无显著性差异。 3.2 补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠 IL-4 含量的影响结果见表 1。由表 1 可见，大 鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，血清 IL-4 含量呈升高趋势，其中补骨脂浸膏、石油醚萃 取物和水提取物各成分组大鼠血清 IL-4 含量升高明显，与哮喘模型组比较 P<0.05 或 P<0.01，差异有显著意义。而醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脱物三成分组大鼠血 清 IL-4 含量升高不明显，与哮喘模型组比较 P>0.05，无显著性差异。 3.3 补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠 IFN-γ 含量的影响结果见表 1。由表 1 可见， 大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，不同溶剂成分大鼠血清 IFN-γ 含量升降不一致，其中 补骨脂浸膏和石油醚萃取物两成分组大鼠血清 IFN-γ 含量升高明显，与哮喘模型组比较 P<0.05，差异有显著意义。醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脱物三成分组大鼠血清 IFN-γ 含量减低显著，与哮喘模型组比较 P<0.05 或 P<0.01，有显著性差异，而补骨脂 水提对 IFN-γ 含量未见明显影响，与哮喘模型组比较 P>0.05，无显著性差异。表 1 不同 提取物对哮喘大鼠 IL-5，IL-4，IFN-γ 含量的影响(略) 3.4 补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠 Th1/mlTh2（IFN-γ/mlIL-5）广东省中医院提供；大鼠的影响哮喘模型组、 醇提浸膏组、石油醚萃取组、甲醇洗脱物组和水提取物组的 Th1/mlTh2 比值依次为 （n=10)：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5，0.8±0.4 和 1.2±0.5。提示，大鼠服用补 骨脂醇提上述 4 种溶剂萃取物后，血清 Th1/mlTh2 比值呈增加明显，与哮喘模型组比较 P<0.05，差异有显著意义。而醋酸乙酯萃取物（0.4±0.2，n=10）广东省中医院提供；大鼠和水萃取物 （0.6±0.2，n=10）广东省中医院提供；大鼠两成分组大鼠血清 Th1/mlTh2 降低或增加不明显，与哮喘模型组比较 P＞0.05，无显著性差异。 4 讨论 哮喘与 Th1 细胞分泌的 IFN-γ 等细胞因子及 Th2 细胞产生的 IL-4，IL-5 等细胞因子 含量和 Th1/mlTh2 比值密切相关。Th2 的主要代表产物 IL-4，能促进 B 细胞产生 IgE，引发 炎症介质释放的链式反应，促进炎症细胞的趋化聚集，引起呼吸道血管通透性增加和粘膜 水肿，平滑肌痉挛及粘液分泌亢进，是引起哮喘的重要因素。Th1 的主要代表产物是 IFNγ，能抑制 IL-4，IL-5 等细胞因子的产生，进而抑制 IgE 的产生和 Eos 活性，抑制 IAR 和 LAR，是哮喘免疫调节中的一个重要的抑制因子，许多细胞因子通过它发挥生物效应 ［8］致敏第。因此，采用 IFN-γ，IL-5，IL-4 作为哮喘敏感指标进行药物筛选具有合理性。补骨 脂是临床上常用的补肾助阳中药，具平喘之功，临床上常用于虚寒喘咳［9］致敏第。补骨脂是 今后应加强研究和开发的抗气道抗炎症中药之一［2］致敏第。我院从 20 世纪 80 年代初使用补 骨脂注射液治疗支气管哮喘取得了理想的疗效，但其作用的物质基础并不清楚。因此，我 们在前期研究的基础上［2，3］致敏第，采用卵蛋白哮喘大鼠为模型，以体内血清 IFN-γ/mlIL-4/ml IL-5 含量变化为指标，初步筛选补骨脂平喘作用的有效部位。 从 IFN-γ 含量变化来看，补骨脂 95%乙醇提取物浸膏和补骨脂 95%乙醇提取石油醚 萃取物作用明显，可能是补骨脂平喘的主要成分，但从抑制 IL-5 和 IL-4 含量分析，补骨脂 95%乙醇提取水萃取物和补骨脂 95%乙醇提甲醇洗脱物对 Th2 细胞产生的 IL-4，IL-5 细 胞因子有较强的抑制作用，其他成分却升高或对 IL-5，IL-4 没有显著影响，而补骨脂水提 取物对 IFN-γ 含量提高作用不明显。另外，补骨脂 95%醇提水萃取物显著降低 IL-5 和 IFN-γ 含量，同时在给药的过程中我们发现水萃取物的毒性明显强于其他成分，这与其肾 毒性是否相关值得关注。根据以上分析，我们初步推测补骨脂平喘有效部位应该主要是醇 提成分：补骨脂 95%乙醇提取物浸膏，补骨脂 95%乙醇提取石油醚萃取物和甲醇洗脱物。 从哮喘中考察 Th1/mlTh2 的比值变化更具有意义［10］致敏第，因此我们以 IFN-γ/mlIL-5 为例， 分析 Th1/mlTh2 的变化，探讨补骨脂 3 个醇提成分（浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脱物）广东省中医院提供；大鼠哪 个为平喘的最佳有效部位。哮喘模型组、醇提浸膏组、石油醚萃取物组和甲醇洗脱物组的 Th1/mlTh2 依次为（n=10）广东省中医院提供；大鼠：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5 和 0.8±0.4，与哮喘组比较 三者的 P<0.05，差异有显著意义，但醇提浸膏的比值更大。因此结合前面的分析，我们 认为三者的平喘作用大小依次为：补骨脂 95%乙醇提取物浸膏>补骨脂 95%乙醇提甲醇 洗脱物=补骨脂 95%乙醇提取石油醚萃取物。