凝血酶原提取分析论文

1 材料与方法 1.1 材料 柠檬酸钠抗凝的新鲜猪血浆。 1.2 主要试剂 纤维蛋白原和凝血酶标准品购自美国 SIGMA 公司，Bradford 蛋白质定量检测试剂盒 购自美国 BioRadRad。其余试剂均为国产分析纯。 柠檬酸钡吸附法使用的四种溶液分别为，溶液 A：1.0mol/LBaCl2 溶液；溶液 B： 0.02mol/LTris，0.15mol/LBaCl2，0.10mol/LNaCl，pH7.4；溶液 C：0.02mol/ LTris，0.10mol/LNaCl，0.20mol/LNa2EDTA，pH7.4；溶液 D：0.02mol/ LTris，0.15mol/LNaCl，pH6.5. 1.3 主要仪器 GEGeneQuant1300 核酸蛋白分析仪 1.4 方法 1.4.1 凝血酶原提取将收集到的 5 份猪血浆按 1～5 编号，各均分为 2 份，其中 1 份采 用等电点沉淀法提取凝血酶原，另 1 份采用柠檬酸钡吸附法提取凝血酶原。 1.4.1.1 等电点沉淀法猪血浆用蒸馏水稀释 10 倍，用 5%冰乙酸将其 pH 调至 5.3，4℃静置过夜，3000r/min 离心 15min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，过滤备用。 1.4.1.2 柠檬酸钡吸附法猪血浆中加入溶液 A，体积比为 10∶1，4℃搅拌 30min，静 置 30min 后，3000r/min 离心 30min，弃上清。沉淀用溶液 B 洗涤，3000r/min 离心 15min，弃上清。重复洗 3 次。沉淀用溶液 C 解吸附，4℃搅拌 0.5～1h，3000r/min 离 心 15min 取上清。上清液用溶液 D 于 4℃透析过夜。3000r/min 离心 15min 取上清液， 即为凝血酶原溶液。 1.4.2 凝血酶原激活用 2%Na2CO3 溶液将凝血酶原溶液的 pH 调至 7.1，加入 0.25mol/LCaCl2 溶液，使 Ca2+终浓度为 0.03mol/L，再用 2%Na2CO3 溶液将凝血酶 原溶液的 pH 调至 7.1，室温静置 2h，过滤即得凝血酶溶液。 1.4.3 凝血酶比活性测定根据文献［4］提供的方法配制 0.1%纤维蛋白原溶液。 凝血酶效价测定［4,5］：取凝血酶标准品，用生理盐水配制成效价(U/mL)U/mL)分别为 5、6、7、8、9、10 的标准品溶液。另取 1×10cm 的塑料试管 6 支，各加入 0.1%纤维 蛋白原溶液 450μll，置 37℃水浴预热 5min，再分别取已 37℃预热的上述 6 个浓度的标 准品溶液各 50μll，迅速加入上述各试管中，立即计时并摇匀，记录凝固时间。每个浓度测 2 次，求平均值，做标准曲线。待测样品用生理盐水稀释适当浓度，取 50μll，按标准曲线 的测定方法平行测定 2 次，求平均值，根据标准曲线或回归方程计算样品的效价。 根据文献［6］，采用 Bradford 法测定样品的蛋白质浓度，以牛血清白蛋白为标准品， 每个样本平行测 2 次，取平均值。根据公式：酶比活性=酶效价/溶液蛋白质浓度，计算凝 血酶溶液的比活性。 2 结果与分析 以凝血酶标准品溶液效价(U/mL)U/mL)为 X，对应的凝固时间（sec）为为 Y 进行直线回归处 理，并求得直线回归方程，所得方程式为：Y=62.913Rad5.994X，r≈0.9948.将凝血酶样 品的凝固时间代入回归方程，即可计算得出样品的凝血酶效价(U/mL)见表 1、图 1)。 采用等电点沉淀法得到的凝血酶原经激活后，凝血酶的比活性为 11.01±1.54U/ mg，而采用柠檬酸钡吸附法提取得到的凝血酶原经激活后，凝血酶的比活性可达到 130.17±12.30U/mg。其比活性经配对样本 t 检验统计学分析后，其概率 P=3.54×10Rad5＜0.01，说明两种方法得到的凝血酶比活性有显著性差异，后者约为前者 的 11.8 倍。从两种方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白质浓度分析，造成两者酶比 活性差异的主要原因在于凝血酶的纯度差异，凝血酶纯度越高，比活性就越高。等电点沉 淀法提取的凝血酶原溶液含杂蛋白较多，需要进一步纯化，以提高酶的比活性。因而，采 用柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原大大优于等电点沉淀法，得到的凝血酶纯度较 高。 3 讨论 从血浆中提取的凝血酶可应用于临床，作为局部止血的首选药物，具有止血快、无副 作用的优点。同时，凝血酶也是纤维蛋白原定量检测试剂盒的主要成分，应用于出凝血疾 病和血栓性疾病的临床检测［7］。由于人血浆资源的限制性，目前国内采用猪血浆提取 凝血酶的报道较多，等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法是两种主要的凝血酶原提取方法，凝 血酶原经单独的钙离子激活即可得到凝血酶。表 1 两种提取方法所得到的凝血酶比活性 等电点沉淀法根据蛋白质在溶液 pH 为其等电点的条件下溶解度最低的原理，用 1% 的醋酸将适当稀释后的血浆 pH 调至凝血酶原的等电点 5.0～5.5 之间，即可使凝血酶原析 出。该方法虽然操作简便，成本较低，但得到的凝血酶含杂蛋白较多，比活性低，达不到 临床药物和检测试剂的纯度要求，还需要进一步的纯化，而纯化步骤越多，酶的回收率则 相应降低，不能有效的利用资源。 柠檬酸钡吸附法则根据柠檬酸钡能吸附依赖于维生素 K 的凝血因子这一特性，在柠檬 酸钠抗凝获得的血浆中加入氯化钡产生柠檬酸钡，凝血酶原等因子随之沉淀分离出来，沉 淀用 EDTA 解吸附，离心去沉淀，上清液经透析后获得凝血酶原溶液。虽然该方法看似操 作较为复杂，但得到的凝血酶纯度较高，可直接用于检测试剂的制备，也可根据目的选择 进行中度纯化，相比等电点沉淀法其回收率更高，实际上节约了成本。 另外，无论是等电点沉淀法还是柠檬酸钡吸附法，最后含有凝血酶原的蛋白沉淀的复 溶过程是影响凝血酶得率的一个关键步骤。在柠檬酸钡吸附法中，用 EDTA 解吸附凝血酶 原应在冰浴中搅拌 0.5h 以上，直至溶液呈现胶冻状态为止，使凝血酶原充分溶解于缓冲 液中。