人工骨修复骨缺损研究论文

【摘要】目的研制理想的能较快修复大段骨缺损的人工骨材料。方法将重组骨形态发 生蛋白-2（rhBMP-2）/透明质酸钠纤维蛋白复合凝胶（HAFG）缓释体系和多孔双相钙磷 陶瓷（BCP）结合研制成 BCP/HAFG-rhBMP-2 人工骨，并分别将 BCP/HAFG-rhBMP-2 和 BCP/rhBMP-2 及 BCP/HAFG 人工骨进行兔桡骨大段骨缺损修复的对比研究。术后分别 行大体、放射学、组织形态学及生物力学测试。结果试验中第 12 周与第 2 周相比较，3 组 碱性磷酸酶（AKP）值下降情况分别为 BPC/HAFG-rhBMP-2 组降低了 65.13%，BPC/ BMP-2 组降低了 71.03%，BPC/HAFG 组降低了 58.59%。组织学及扫描电镜观察显 示:12 周时 BPC/HAFG-rhBMP-2 组材料已基本被成熟骨组织所代替，新骨结构与宿主骨 无差别，而 BPC/HAFG 和 BPC/rhBMP-2 组骨小梁结构疏松细小，材料仍未完全被降解， 材料与骨组织间形成较大间隙。术后 12 周时 3 组材料植入部位骨组织极限抗压强度分别 为:BCP/HAFG-rhBMP-2 组（538±12.7）N、BCP/BMP-2 组（368±24.0）N、BCP/ HAFG 组（256±8.4）N。BPC/HAFG-BMP-2 复合型人工骨较 BCP/BMP-2 及 BCP/ HAFG 人工骨具有更强、更持久的诱导成骨活性。结论 BCP/HAFG-rhBMP-2 人工骨能更 快促进长骨大段骨缺损的修复，是一种较理想的人工骨材料。 【关键词】骨和骨组织;骨移植;生物力学 为寻找理想的人工骨组织材料，本实验将多孔双相钙磷陶瓷（BCP）同重组骨形态发 生蛋白-2（rhBMP-2）/透明质酸钠（HA）和纤维蛋白复合凝胶（HAFG）缓释体系结合， 制成 BCP/HAFG-rhBMP-2 人工骨材料，进行修复长骨大段骨缺损的实验。 1 材料与方法 1.1 人工骨材料的制备 （1）BCP 由东南大学材料科学与工程学院生物材料研究组研制提供。该 BCP 材料呈 白色多孔状结构，孔道彼此连通，孔径约为 300μmm，孔隙率为 80%。试验中将 BCP 制成 长 10mm，直径 4mm 圆柱体。 （2）BCP/HAFG-rhBMP-2 人工骨的制备:在 BCP 植入前用特制双管注射器将混有等 量 rhBMP-2 的 HAFG 复合凝胶缓慢滴注入 BCP，使其在 BCP 表面涂布均匀。待复合凝胶 由流体状变为灰白色半钢性状态时植入缺损部位。同法制备并植入 BCP/HAFG 人工骨。 （3）BCP/rhBMP-2 工骨的制备:利用部分真空吸入法［1］将 rhBMP-2 和 BCP 结合在一 起。制成的每支人工骨中约含 rhBMP-21mg，植入前人工骨在密封包装下环氧乙烷气体 消毒 24h。 1.2 实验动物及分组 新西兰兔 60 只，体重 2.5～3.2kg，雌雄不限。随机分为 3 组:A 组为 BCP/HAFGrhBMP-2 组;B 组为 BPC/rhBMP-2 组;C 组为 BPC/HAFG 组。 1.3 实验方法 用质量分数为 3%的戊巴比妥钠（1ml·kg-1）静脉麻醉后，每兔随机选用左右侧前肢， 经剃毛、消毒，取桡侧切口切开皮肤及皮下组织，显露桡骨干中段，用单片小锯锯下 10mm 连带骨膜骨段，然后按组分别植入相应人工骨材料。术后给予庆大霉素 10000U·kg-1，每日 2 次肌肉注射，连续注射 3d。常规条件下喂养观察。 1.4 大体观察 观察动物的饮食、活动、伤口反应，术后第 2、4、8、12 周分批处死动物并取材， 观察植入材料的表面、局部成骨及炎症反应等情况。 1.5X 线观察 术后第 4、8、12 周摄片，由 3 人盲法按照 Lane-sandhuX 射线评分标准［2］进行 评分。 1.6 碱性磷酸酶（AKP）活性检测术后第 2、4、8、12 周 3 组各取 5 只动物，全麻后， 从心脏抽血 3ml 离心，使用 AKP 试剂盒行血清 AKP 活性测定。 1.7 桡骨生物力学检测 术后 12 周时，每组各取 5 个标本及正常桡骨标本作力学强度测试。以材料植入处为 中心截取桡骨长约 1.4cm。经牙托粉两端包埋后，置于 MTS-858minibionixII 型生物力 学测试机上进行垂直压缩试验。加载速度为 1mm·min-1，最大位移设定 3mm。每隔 0.1s 记录一次数据。 1.8 组织病理学观察 将每次所获取的桡骨标本作好标记置于 10%甲醛中固定 24h 后，经 EDTA 脱钙、梯 度酒精脱水、石蜡包埋，沿桡骨纵轴连续切片，厚度为 6μmm，HE 染色，光学显微镜下观 察。 1.9 扫描电镜观察 于术后第 2、4、8、12 周每组各取 3 个标本，2.5%戊二醛（pH7.2～7.4）固定 2h，然后用 PBS 缓冲液冲洗 2 次，1%锇酸 PBS 液固定 2h，再用 PBS 缓冲液冲洗 2 次， 乙腈逐级脱水，真空干燥，表面离子溅射喷金处理，HITACHIS-520 扫描电镜下观察标本 的超微结构。 2.0 统计学处理 采用 SPSS11.5 统计软件包，每组测得的 X 线评分、AKP 水平及生物力学评分采用方 差及 SNK 分析，统计学显著水平为 α=0.05。 2 结果 2.1 大体观察 术后动物前肢不能负重，跛行，术后 1 周恢复正常活动。所有动物切口均Ⅰ期愈合。期愈合。 术后 2 周时，A、B 组材料植入区有明显骨痂生成，而 C 组材料外周为纤维结缔组织包裹。 术后 8 周，A 组材料已部分降解，新生骨组织的形成量明显高于 B、C 组。12 周 A 组骨缺 损完全修复，而其他组骨缺损处仍可见到未吸收的材料及骨缺损（图 1）。 BCP/HAFG-rhBMP-2 组骨缺损完全修复，骨皮质塑形良好（左）;BPC/HAFG 组材料 未完全降解，缺损部分修复（中）;BCP/rhBMP-2 组骨缺损大部分愈合，仍可见少量未降 解材料（右） 2.2 组织学观察结果 术后 2 周时，A、B 组材料外周新骨开始形成，材料与新骨直接结合，材料内部孔隙 中有纤维结缔组织间充质细胞进入（图 2）。C 组材料外周为纤维结缔组织包裹，偶见炎 性细胞浸润，材料内部可见纤维结缔组织填充。术后 4 周，各组骨缺损植入体孔隙中均有 软骨细胞生成，其中 A 组软骨细胞量明显高于 B、C 组，材料均未见明显降解。术后 8 周， A 组材料已部分降解，材料内、外新骨继续增多。B、C 组植入的材料少量降解，成骨较稀 少，主要位于材料的边缘区域。12 周时，A 组材料已基本降解，新生骨组织的形成量明显 高于 B、C 组。孔隙中有大量成熟的条索状板层骨形成，骨细胞排列规则，骨小梁较粗大， 分布均匀，其间有骨髓组织，中心区板层骨较多，软骨较少（图 3）。B、C 组植入物孔隙 中也出现板层骨，但以周边为主，其间偶见少量骨髓组织，中心区板层骨及软骨均较少。 2.3AKP 活性的变化 术后不同时间点 3 组 AKP 测定结果，见表 1。在第 2 周，B 组较 A 组和 C 组均明显增 高（P<0.05）;随着术后时间的延长，各组 AKP 活性逐渐降低，其中 B 组降低较快，8 周 时 A 组 AKP 活性较其他两组高，差异有显著性（P<0.05）;A 组与 C 组的 AKP 降低幅度 较平缓。在第 2～12 周时间段内，第 12 周与第 2 周相比较，A 组降低了 65.13%，B 组 降低了 71.03%，C 组降低了 58.59%。12 周时各组 AKP 活性均恢复至正常水平。表 13 组术后各时间点 AKP 活性的变化（略） BPC/HAFG-rhBMP-2 材料与新骨之间及材料内部孔隙中有纤维结缔组织和间充质细 胞进入新生骨组织的骨小梁规则，骨髓腔及骨髓已形成，软骨细胞较。 2.4 生物力学测试结果 术后 12 周时 A、B、C 组植入材料和正常桡骨组的极限抗压强度分别为 （538±12.7）N、（368±24.0）N、（256±8.4）N 和（547±14.8）N。A 组的极限 抗压强度与正常桡骨非常接近，无显著性差异（P>0.05），且两者的抗压强度均明显高 于 B 组和 C 组，统计学分析差异有显著性（P<0.05）。 2.5 扫描电镜检查 术后 2 周 A、B 组可见排列致密的胶原纤维及大量钙盐结晶及小梁状新骨形成，C 组 未见明显钙结晶沉淀。4 周时 A 组材料与骨界面形成骨组织与宿主骨结合，但新骨结构疏 松，随时间延长，骨组织逐渐转向致密。到 12 周时 A 组材料已基本被成熟骨组织所代替， 新骨结构与宿主骨无明显差别（图 4）。而 C 和 B 组骨小梁结构疏松细小（图 5），材料 仍未完全被降解，材料与骨组织间形成较大间隙（图 6）。 2.6X 线检查 （1）B 组:4 周时材料与骨界面形成骨组织与宿主骨小梁粗大，密集，较少见到骨吸 收陷窝材料仍未完全被降解，可见羟基磷灰石结晶，材料与骨组织间形成较大间隙骨紧密 结合，骨缺损内见密度较高的 BCP 影，周围有中等量骨痂形成;8 周时 BCP 影密度降低， 周围骨痂形成较前有所增多;12 周时 BCP 影部分消失，骨缺损大部分愈合，骨髓腔部分再 通（图 7）。 （2）A 组:4 周时移植材料与两骨端融合，骨缺损区有较多骨痂形成;8 周时部分骨缺 损已愈合，骨髓腔部分再通;12 周时全部骨缺损已愈合，皮质骨塑形良好，骨髓腔完全再 通（图 8）。 （3）C 组:4 周时 BCP 影清晰;8 周时 BCP 影密度降低，有少量骨痂形成;12 周时大部 分骨缺损仍存在（图 9）。Lane-sandhuX 射线评分结果见表 2。表 23 组术后各时间点 X 射线评分结果（略） 3 讨论 3.1 骨缺损的形成及治疗 由于某种因素如外伤、感染、肿瘤等而使骨丧失了一些骨质，形成较大的间隙，称为 骨缺损。骨缺损修复最常用的方法是自体骨或异体骨移植，但自体骨移植的不足是取骨数 量受限、影响供骨区生物力学强度和功能、增加患者创伤和痛苦;异体骨具有自体骨一些优 越的组织特点及可减少手术次数，但其存在免疫排斥反应，并有感染 HIV 和肝炎病毒等可 能，而且制样、处理和存贮的成本很高。为克服自体骨和异体骨移植的缺点，人们开始探 索利用生物材料修复骨缺损。目前，用于骨缺损修复的生物材料主要有两大类，一类为人 工合成生物材料，如聚乳酸（PLA）、钙磷陶瓷、聚乙醇烯（PVA）等;另一类为天然高分 子材料，如胶原、骨生长因子（BMP）、明胶等。其中聚乳酸类因缺乏骨传导性、机械强 度差及降解产物酸性大等缺点，使其在应用上受到了限制。与其相比生物活性陶瓷具有较 好的生物相容性和骨传导性能。因而近年来国内外对生物活性陶瓷骨替代材料的研究日趋 增多。目前对该类材料的研究主要着眼于利用先进的加工技术将其与各种活性因子进行复 合，以获得更好的骨缺损修复能力。 3.2BCP/HAFG-rhBMP-2 复合人工骨生物学特性及成骨作用 多孔双相钙磷陶瓷材料以钙、磷为主要成分，与骨基质中的无机成分相似。大量实验 证明它具有良好的生物相容性和降解性，但缺乏骨诱导活性［3］。试验中将双相钙磷陶 瓷多孔支架与 HAFG-rhBMP-2 缓释体系进行了复合，从而使该材料在具有良好的生物相 容性及骨传导作用的基础上，又获得了较持久的体内诱导成骨能力。骨形态发生蛋白 （bonemorphogenicprotein，BMP）是一种广泛分布于各种动物骨组织中的酸性多肽， 具有骨诱导活性。但单纯的 BMP 在体内易被蛋白酶分解，其生物学活性难以得到持续性发 挥［4］。为了克服这一问题，目前的研究主要是利用有机高分子化合物制成 BMP 缓释微 球以获得体内缓释的效果，但在微球的制备工艺中常需要有机溶剂等理化因素的处理，这 使 BMP 的生物活性受到了影响。本实验中选择 HAFG 复合凝胶作为 rhBMP-2 的缓释载体， 利用纤维蛋白原发生快速 γ 交联和缓慢的 α 交联后形成半刚性三维网状纤维蛋白凝块，能 将 HA/rhBMP-2 固定于纤维蛋白凝块网孔内的特性，大大降低了 HA 在植入局部的溶散率， 同时还避免了组织液及纤维蛋白酶过快地进入纤维蛋白凝块内部，从而使 HAFG-rhBMP-2 复合凝胶缓释体系能在机体内存留较长的时间［5］。 BPC/HAFG-BMP-2 复合型人工骨的作用机制及优点如下。（1）生物相容性:本试验 将 BCP 与 HAFG 进行复合，使材料在成分及结构上与天然骨更为接近，再加上透明质酸 及纤维蛋白凝胶聚合时释放各种生物活性因子，使得细胞更易于在材料表面黏附、增殖并 分泌基质。因此该复合材料具有比单纯 BCP 更为良好的生物相容性。（2）骨诱导性:实验 中将 rhBMP-2 与 HAFG 制成缓释体系后再和 BCP 进行了复合。由于 HA 带大量的负电荷， 能与带正电的 rhBMP-2 形成较好结合，再加上三维网状纤维蛋白凝块具有较强的吸附及 降低 HA/BMP 溶散的作用，使得 rhBMP-2 可随着复合凝胶的降解缓慢释放，能较长时间 保持局部有效浓度。试验中对 AKP 检测及组织学的观察结果均提示 BPC/HAFG-rhBMP-2 复合型人工骨的诱导成骨活性较 BPC/rhBMP-2 人工骨更为持久。（2）生物降解性:由于 羟基磷灰石和磷酸三钙（tricalciumphos-phate，TCP）在体内降解速度过快，与新骨生 长速度不匹配，同时也影响材料植入后的稳固性能［6］。试验中利用羟基磷灰石的高强 度、高生物活性及稳定性，将其与 TCP 合成 BCP 系统，使得材料在体内的降解与新骨的 生长更为匹配。（3）骨传导性:BCP 主要是依靠它的三维多孔结构，尤其是它的合适孔径 和孔隙间的连通，为成骨细胞的长入提供支撑作用［7］。 因此，BPC/HAFG-rhBMP-2 人工骨是一种较理想的骨移植替代材料，具有较高的临 床实用价值。但多孔 BCP 本身在力学强度及脆性方面还有一定的缺陷，所以将其作为负重 骨缺损的修复材料还需要作进一步探讨。 【摘要】目的探讨帕罗西汀对脑卒中抑郁的治疗及神经功能康复的影响。方法将 60 例脑卒中抑郁患者随机分为两组各 30 例，两组在神经内科常规治疗的基础上研究组联用 帕罗西汀治疗。于治疗第 4、10w 采用汉密尔顿抑郁量表评定临床疗效，于治疗前后采用 神经功能缺损量表评定神经功能缺损程度，并进行对比分析。结果治疗 10w 末汉密尔顿抑 郁量表评定，两组有效率比较差异有极显著性（P<0.01）。神经功能缺损量表评定，研 究组治疗后神经功能改善明显优于对照组（P<0.01）。结论脑卒中后抑郁影响患者神经 功能康复，抗抑郁治疗能促进卒中后神经功能康复。 【关键词】帕乐西汀；脑卒中后抑郁；康复 脑卒中是当前危害我国中老年人生命与健康的重要疾病，卒中后抑郁 （poststrokedepression，PSD）是脑血管意外的常见并发症，在躯体致残的同时，心 理致残也十分严重。国外研究发现脑卒中患者的抑郁发生率为 40.1%［1］，我国发生率 为 34.2%［2］。脑卒中患者发病后抑郁情绪与疾病的发展、疗效和预后有密切关系，因 而选择合理的药物来改善其抑郁情绪倍受重视［3］。我们应用帕乐西汀对卒中后抑郁患 者进行了临床对比研究，现将报告如下。 1 资料与方法 1.1 对象选取在我院住院治疗的 60 例卒中后抑郁患者为研究对象。其中男 40 例，女 20 例；平均年龄 60±12a。入组标准：（1）均符合 1995 年全国第 4 届脑血管病学术会 议制定的脑卒中诊断标准，并经 CT 证实；（2）均符合《中国精神疾病分类方案与诊断标 准》第 3 版（CCMD3）抑郁症诊断标准；（3）排除既往有神经、精神病史及检查不合作 者。将入组患者随机分为研究组（帕罗西汀治疗组）与对照组（常规治疗组）各 30 例。 两组性别、年龄、职业、文化程度均无显著性差异（P＞0.05）。 1.2 方法 1.2.1 给药方法两组均给予神经内科常规治疗及康复治疗。研究组入组前停服用其他 抗抑郁剂，并进行 1w 清洗期后服用帕罗西汀治疗，未服用抗抑郁剂者直接服用帕罗西汀， 起始剂量 10mg・d－1，早餐后服用，第 2w 增加至 20mg・d－1。 1.2.2 疗效评定采用汉密尔顿抑郁量表（HAMD）［4］评定临床疗效，于治疗第 4、10w 末各评定 1 次；神经功能缺损量表评定神经功能缺损程度，于治疗前后各评定 1 次，两组间进行对比分析；疗效评定标准：HAMD 减分率≥75%为痊愈，≥50%为显效， ≥25%为有效，＜25%为无效。所有数据以±s 表示，采用 χ2 检验。 2 结果