抗汞引起肾细胞凋亡研究论文

【摘要】目的探讨血红素氧合酶-1（HO-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机 制。方法 64 只雄性 Wistar 大鼠随机分为对照组、单纯染汞组、HO-1 诱导组和 HO-1 抑 制组，每组 16 只。先分别腹腔注射生理盐水、空白液、血晶素、锌原卟啉Ⅸ（Ⅸ（ZnPPⅨ）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机 预处理，8hh 后处死各组内半数鼠取肾查 HO-1 表达水平与活性，余鼠除对照组注射生理盐 水外，其余 3 组均腹腔注射 HgCl2（2mg·kg-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，24h 后检测血肌酐（Cr）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、尿素氮 （BUN）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机及肾内总抗氧化能力（TAOC）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、丙二醛（MDA）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、Bcl-2 蛋白表达水平与细胞 凋亡指数（AI）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。结果与对照组比较，单纯染汞组 TAOC 降低而 MDA、Cr、BUN、Bcl-2 表达水平和 AI 均明显增加（P<0.01）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，HO-1 抑制组除 Bcl-2 表达受抑外，其余指标的 变化与单纯染汞组相似，但更为显著。HO-1 诱导组与单纯染汞组及 HO-1 抑制组比较， TAOC 及 Bcl-2 表达均显著升高，而 MDA、Cr、BUN 及 AI 则明显降低（均 P<0.01）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。 结论 HO-1 通过抗氧化、上调 Bcl-2 蛋白表达水平而对抗汞引起肾细胞凋亡的作用。 【关键词】血红素氧合酶-1;肾;汞;凋亡;大鼠 氯化汞（HgCl2）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机是一种肾毒性药物，常用于制作急性肾功能衰竭的动物模型。近年 研究揭示，汞能促进细胞线粒体产生大量 H2O2 等活性氧，后者进一步诱导的细胞凋亡在 汞所致的急性肾衰中起着重要作用［1-2］。血红素氧合酶-1（HO-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机是一种抗氧化酶， 广泛参与各种组织细胞应对氧化应激时的防御机制，是机体拮抗氧化应激损伤最重要的内 源性保护物质，但 HO-1 能否抑制汞介导的肾细胞凋亡及急性肾损伤罕见报道。为此，我 们拟应用血晶素与锌原卟啉Ⅸ（Ⅸ（Zn-PPⅨ）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机分别特异性诱导与抑制 HO-1，以探明 HO-1 对 HgCl2 引起大鼠肾细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 血晶素、ZnPPⅨ 为 Sigma 公司产品。肌酐（Cr）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、尿素氮（BUN）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、丙二醛 （MDA）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、总抗氧化能力（TAOC）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、兔抗鼠多克隆 HO-1IgG 抗体及 Bcl-2IgG 抗体、 SABC 免疫组化染色试剂盒及 DAB 显色试剂等均购自武汉博士德生物工程有限公司。 TUNEL 法凋亡检测试剂盒购于 Boehringer 公司，其它试剂均为分析纯。 1.2 动物分组与标本采集 选用健康雄性 Wistar 大鼠 64 只（体重 250～310g）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，随机分为 4 组:对照组、单纯 染汞组、HO-1 诱导组和 HO-1 抑制组，每组 16 只。预先分别给各组大鼠腹腔注射等量生 理盐水、空白液（由 0.1mmol·L-1NaOH 和 0.1mmol·L-1PBS 液按体积比 1∶24 配制而 成的混合溶液）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、溶于空白液中的血晶素（30mg·kg-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机及 ZnPPⅨ（20mg·kg1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，8hh 后，每组均任挑 8h 只处死，取肾脏，一部分肾置于 4%的中性甲醛液中固定作 HO-1 免疫组化染色，其余部分于-8h0℃保存待测 HO-1 活性。余鼠除对照组经腹腔注射等 量生理盐水外，其余 3 组均经腹腔注射 HgCl2（2mg·kg-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机溶液，动物自由进食饮水， 24h 后各组大鼠经 2%戌巴比妥钠 40mg·kg-1 腹腔注射麻醉，开腹经下腔静脉抽血检测 肌酐（Cr）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机、尿素氮（BUN）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，然后迅速摘出肾脏，取部分肾组织置于 4%的中性甲醛液 中固定，剩余肾组织于-8h0℃保存待测各项生化指标。 1.3 免疫组化检测 取上述甲醛液固定肾组织，常规石蜡包埋切片（厚 6μmm）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，二甲苯脱蜡，梯度酒精至 水，于 1g·L-1TBS 中微波修复抗原 10min，再置于 3%H2O2 中 15min，灭活内源性酶， PBS 液反复冲洗 3 次，采用 SABC 法按试剂盒说明书分别滴加 HO-1 或 Bcl-2 抗体（抗体 滴度均为 1∶200）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，DAB 显色，封片，400 倍镜下随机选择 5 个不重叠视野观察肾小管上 皮细胞，胞浆见棕色颗粒者为阳性染色细胞。HO-1 蛋白表达量采用 CD-8h 病理彩色图像 分析系统测定平均光密度值表示，Bcl-2 蛋白表达量采用阳性染色指数（PI）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机表示， PI（%）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机=阳性染色细胞数/视野内所有细胞数×100%。 1.4 生化指标检测 血 Cr、BUN 分别采用苦味酸法和二乙酰法，按试剂盒说明书测定。肾组织 TAOC 和 MDA 采用化学比色法，操作按试剂盒说明书进行。另取各肾组织标本约 0.5g，加蔗糖 Tris 缓冲液制成组织匀浆，差速离心法分离微粒体，考马亮蓝法测定蛋白浓度，根据 HO1 降解血红素生成胆红素的原理，参照何洁［3］的方法测定 HO-1 活性，以 1mg 蛋白 1h 催化血红红蛋白降解生成胆红素的量表示肾组织 HO-1 活性（nmol·mg-1·h-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。 1.5TUNEL 法检测细胞凋亡 肾组织经 4%中性甲醛液固定过夜，脱水，透明，石蜡包埋，切片（厚 6μmm）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，置于 包被有多聚赖氨酸的载玻片上，严格按试剂盒说明书进行操作，最后用苏木素复染细胞核， 400 倍光镜下观察，胞核染成棕黄色者为凋亡细胞，每张切片选 10 个不重叠视野，每个 视野连续计数 100 个肾小管上皮细胞，以凋亡细胞所占的百分比作为凋亡指数（AI）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。 1.6 统计学分析 所得数据均为计量资料，以 x-±s 表示，组间比较采用 F 及 q 检验，应用 SPSS11.5 软件进行统计分析。 2 结果 2.1 肾组织内 HO-1 蛋白表达与活性 免疫组化染色显示，仅 HO-1 诱导组出现 HO-1 明显表达，主要定位于肾小管上皮细 胞的胞浆中，表现为肾小管上皮细胞胞浆普遍被染成棕褐色，对应的 HO-1 活性也显著升 高。而其余 3 组肾内 HO-1 表达较少，染色极浅，对应的 HO-1 活性也较低，其中 HO-1 抑制组 HO-1 活性显著降低。组间比较见表 1。表 1 各组 HO-1 蛋白表达与活性水平比较 （略）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机 2.2 肾组织及血生化指标检测结果 与对照组比较，单纯染汞组及 HO-1 抑制组 TAOC 降低而 MDA、Cr、BUN 均明显升 高，HO-1 诱导组则 TAOC 明显升高（P<0.01）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机，MDA、Cr、BUN 虽有升高趋势，但无 显著性差异（P>0.05）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。与单纯染汞组比较，HO-1 诱导组 TAOC 明显升高，而 MDA、Cr、BUN 均显著下降，HO-1 抑制组则相反，TAOC 明显下降，而 MDA、Cr、BUN 均显著升高。H O-1 诱导组与 HO-1 抑制组间各指标均有显著性差异（均 P<0.01）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。见表 2。表 2 各组血生化检测结果比较（略）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机 2.3Bcl-2 蛋白表达 对照组肾内几乎不表达 Bcl-2，单纯染汞组 Bcl-2 阳性染色细胞在近曲小管较常见， 远曲小管相对较少，HO-1 诱导组肾小管 Bcl-2 阳性染色细胞显著增多，而 HO-1 抑制组 肾小管 Bcl-2 阳性染色细胞则较少，各组间比较见表 3。表 3 各组 Bcl-2 蛋白表达及细胞 凋亡情况比较（略）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机 2.4 细胞凋亡检测结果 对照组肾内凋亡细胞数少见。单纯染汞组见凋亡细胞，主要为近曲小管上皮细胞出现 凋亡，与之相比较，HO-1 诱导组细胞凋亡明显减少，而 HO-1 抑制组细胞凋亡则显著增 多，组间比较见表 3。 3 讨论 肾脏是无机汞攻击的主要靶器官，但汞致肾损伤的确切分子机制尚未完全阐明。已有 研究显示，给予 HgCl2 能够显著增加肾内 H2O2 等活性氧生成［4］，降低肾内重要抗氧 化剂谷胱甘肽的含量，并降低肾内超氧化物歧化酶的活力，同时生成过量的脂质过氧化产 物丙二醛［5-6］。当给予外源性抗氧化剂或自由基清除剂，则可明显减轻 HgCl2 所致的 肾损伤，从而提示促氧化应激是汞致急性肾损伤的重要机制［5］，进一步研究发现，活 性氧除直接引起生物膜脂质过氧化导致细胞不可逆损伤外，还可通过激活 P38hMAPK 等多 途径介导细胞凋亡［7］。本研究结果也显示，单纯染汞组较对照组肾内 TAOC 显著降低， MDA 生成增多，出现肾小管上皮细胞凋亡增加和肾功能降低，从而证实了 HgCl2 的氧化 应激性肾损伤机制。HO-1 是近年倍受重视的细胞内源性抗氧化酶，本质上属于应激蛋白， 能在各种氧化应激状态下出现适应性表达，发挥抗氧化等多种细胞保护作用。HO-1 的抗 氧化性源于其对促氧化的游离血红素的降解及生成具有强大抗氧化能力的胆红素，后者能 非特异性清除多种自由基［8h］。本研究结果显示，预先应用血晶素诱导 HO-1 蛋白表达 及活性升高后，可明显升高肾组织 TAOC，降低 MDA 生成，抑制细胞凋亡并改善肾功能， 而预先抑制 HO-1 蛋白的活性，则会加重汞所致的氧化应激损伤，增加细胞凋亡并使肾功 能恶化，从而支持抗氧化作用是 HO-1 抗汞所致细胞凋亡和肾功能损伤的重要机制。 曹秉振等［9］报道，汞可能通过下调 Bcl-2 蛋白表达、激活 caspase-3，从而引起 大鼠小脑颗粒细胞凋亡。本研究中，我们也对肾组织内 Bcl-2 的变化作了检测，结果显示， 预先诱导 HO-1 蛋白表达可以显著上调肾内 Bcl-2 表达，反之，抑制 HO-1 表达则下调 Bcl-2 表达水平。Bcl-2 是迄今发现最重要的抗凋亡蛋白之一，主要通过抑制 Bax 的促凋 亡作用、维持细胞钙稳定、抑制细胞色素 C 进入细胞浆等，最终抑制由凋亡蛋白酶 （caspase）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机激活所介导的细胞凋亡［10］。因此，HO-1 上调 Bcl-2 表达水平可能是其 抗汞致肾细胞凋亡的另一重要机制，至于 HO-1 如何上调 Bcl-2 表达尚不清楚。文献资料 提示，HO-1 通过降解血红素生成的另一重要产物 CO 可能是其抗细胞凋亡作用的重要执 行者［11］。 【摘要】目的研制理想的能较快修复大段骨缺损的人工骨材料。方法将重组骨形态发 生蛋白-2（rhBMP-2）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机/透明质酸钠纤维蛋白复合凝胶（HAFG）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机缓释体系和多孔双相钙磷 陶瓷（BCP）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机结合研制成 BCP/HAFG-rhBMP-2 人工骨，并分别将 BCP/HAFG-rhBMP-2 和 BCP/rhBMP-2 及 BCP/HAFG 人工骨进行兔桡骨大段骨缺损修复的对比研究。术后分别 行大体、放射学、组织形态学及生物力学测试。结果试验中第 12 周与第 2 周相比较，3 组 碱性磷酸酶（AKP）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机值下降情况分别为 BPC/HAFG-rhBMP-2 组降低了 65.13%，BPC/ BMP-2 组降低了 71.03%，BPC/HAFG 组降低了 58h.59%。组织学及扫描电镜观察显 示:12 周时 BPC/HAFG-rhBMP-2 组材料已基本被成熟骨组织所代替，新骨结构与宿主骨 无差别，而 BPC/HAFG 和 BPC/rhBMP-2 组骨小梁结构疏松细小，材料仍未完全被降解， 材料与骨组织间形成较大间隙。术后 12 周时 3 组材料植入部位骨组织极限抗压强度分别 为:BCP/HAFG-rhBMP-2 组（538h±12.7）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机N、BCP/BMP-2 组（368h±24.0）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机N、BCP/ HAFG 组（256±8h.4）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机N。BPC/HAFG-BMP-2 复合型人工骨较 BCP/BMP-2 及 BCP/ HAFG 人工骨具有更强、更持久的诱导成骨活性。结论 BCP/HAFG-rhBMP-2 人工骨能更 快促进长骨大段骨缺损的修复，是一种较理想的人工骨材料。 【关键词】骨和骨组织;骨移植;生物力学 为寻找理想的人工骨组织材料，本实验将多孔双相钙磷陶瓷（BCP）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机同重组骨形态发 生蛋白-2（rhBMP-2）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机/透明质酸钠（HA）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机和纤维蛋白复合凝胶（HAFG）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机缓释体系结合， 制成 BCP/HAFG-rhBMP-2 人工骨材料，进行修复长骨大段骨缺损的实验。 1 材料与方法 1.1 人工骨材料的制备 （1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机BCP 由东南大学材料科学与工程学院生物材料研究组研制提供。该 BCP 材料呈 白色多孔状结构，孔道彼此连通，孔径约为 300μmm，孔隙率为 8h0%。试验中将 BCP 制成 长 10mm，直径 4mm 圆柱体。 （2）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机BCP/HAFG-rhBMP-2 人工骨的制备:在 BCP 植入前用特制双管注射器将混有等 量 rhBMP-2 的 HAFG 复合凝胶缓慢滴注入 BCP，使其在 BCP 表面涂布均匀。待复合凝胶 由流体状变为灰白色半钢性状态时植入缺损部位。同法制备并植入 BCP/HAFG 人工骨。 （3）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机BCP/rhBMP-2 工骨的制备:利用部分真空吸入法［1］将 rhBMP-2 和 BCP 结合在一 起。制成的每支人工骨中约含 rhBMP-21mg，植入前人工骨在密封包装下环氧乙烷气体 消毒 24h。 1.2 实验动物及分组 新西兰兔 60 只，体重 2.5～3.2kg，雌雄不限。随机分为 3 组:A 组为 BCP/HAFGrhBMP-2 组;B 组为 BPC/rhBMP-2 组;C 组为 BPC/HAFG 组。 1.3 实验方法 用质量分数为 3%的戊巴比妥钠（1ml·kg-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机静脉麻醉后，每兔随机选用左右侧前肢， 经剃毛、消毒，取桡侧切口切开皮肤及皮下组织，显露桡骨干中段，用单片小锯锯下 10mm 连带骨膜骨段，然后按组分别植入相应人工骨材料。术后给予庆大霉素 10000U·kg-1，每日 2 次肌肉注射，连续注射 3d。常规条件下喂养观察。 1.4 大体观察 观察动物的饮食、活动、伤口反应，术后第 2、4、8h、12 周分批处死动物并取材， 观察植入材料的表面、局部成骨及炎症反应等情况。 1.5X 线观察 术后第 4、8h、12 周摄片，由 3 人盲法按照 Lane-sandhuX 射线评分标准［2］进行 评分。 1.6 碱性磷酸酶（AKP）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机活性检测术后第 2、4、8h、12 周 3 组各取 5 只动物，全麻后， 从心脏抽血 3ml 离心，使用 AKP 试剂盒行血清 AKP 活性测定。 1.7 桡骨生物力学检测 术后 12 周时，每组各取 5 个标本及正常桡骨标本作力学强度测试。以材料植入处为 中心截取桡骨长约 1.4cm。经牙托粉两端包埋后，置于 MTS-8h58hminibionixII 型生物力 学测试机上进行垂直压缩试验。加载速度为 1mm·min-1，最大位移设定 3mm。每隔 0.1s 记录一次数据。 1.8h 组织病理学观察 将每次所获取的桡骨标本作好标记置于 10%甲醛中固定 24h 后，经 EDTA 脱钙、梯 度酒精脱水、石蜡包埋，沿桡骨纵轴连续切片，厚度为 6μmm，HE 染色，光学显微镜下观 察。 1.9 扫描电镜观察 于术后第 2、4、8h、12 周每组各取 3 个标本，2.5%戊二醛（pH7.2～7.4）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机固定 2h，然后用 PBS 缓冲液冲洗 2 次，1%锇酸 PBS 液固定 2h，再用 PBS 缓冲液冲洗 2 次， 乙腈逐级脱水，真空干燥，表面离子溅射喷金处理，HITACHIS-520 扫描电镜下观察标本 的超微结构。 2.0 统计学处理 采用 SPSS11.5 统计软件包，每组测得的 X 线评分、AKP 水平及生物力学评分采用方 差及 SNK 分析，统计学显著水平为 α=0.05。 2 结果 2.1 大体观察 术后动物前肢不能负重，跛行，术后 1 周恢复正常活动。所有动物切口均Ⅰ期愈合。期愈合。 术后 2 周时，A、B 组材料植入区有明显骨痂生成，而 C 组材料外周为纤维结缔组织包裹。 术后 8h 周，A 组材料已部分降解，新生骨组织的形成量明显高于 B、C 组。12 周 A 组骨缺 损完全修复，而其他组骨缺损处仍可见到未吸收的材料及骨缺损（图 1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。 BCP/HAFG-rhBMP-2 组骨缺损完全修复，骨皮质塑形良好（左）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机;BPC/HAFG 组材料 未完全降解，缺损部分修复（中）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机;BCP/rhBMP-2 组骨缺损大部分愈合，仍可见少量未降 解材料（右）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机 2.2 组织学观察结果 术后 2 周时，A、B 组材料外周新骨开始形成，材料与新骨直接结合，材料内部孔隙 中有纤维结缔组织间充质细胞进入（图 2）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。C 组材料外周为纤维结缔组织包裹，偶见炎 性细胞浸润，材料内部可见纤维结缔组织填充。术后 4 周，各组骨缺损植入体孔隙中均有 软骨细胞生成，其中 A 组软骨细胞量明显高于 B、C 组，材料均未见明显降解。术后 8h 周， A 组材料已部分降解，材料内、外新骨继续增多。B、C 组植入的材料少量降解，成骨较稀 少，主要位于材料的边缘区域。12 周时，A 组材料已基本降解，新生骨组织的形成量明显 高于 B、C 组。孔隙中有大量成熟的条索状板层骨形成，骨细胞排列规则，骨小梁较粗大， 分布均匀，其间有骨髓组织，中心区板层骨较多，软骨较少（图 3）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机。B、C 组植入物孔隙 中也出现板层骨，但以周边为主，其间偶见少量骨髓组织，中心区板层骨及软骨均较少。 2.3AKP 活性的变化