锦红片影响胆管炎大鼠胸腺论文

【摘要】探讨急性胆管炎状态下细胞免疫中枢胸腺的变化以及中药锦红片的干预作用。 方法:雄性清洁级 SD 大鼠 24 只，随机分为 3 组，每组 8 只。胆总管单纯结扎组（简称单 纯结扎组）:结扎胆总管，但不注射细菌，手术后喂生理盐水;模型组:建立大鼠急性胆管炎 模型，造模手术后喂生理盐水;锦红片治疗组:造模手术后喂锦红片悬液。手术后 5dd 处死大 鼠，胸腺取材，做胸腺电镜和光镜形态学观察，并检测胸腺质量、胸腺指数、凋亡指数、 胸腺 Bcl-2 基因编码蛋白表达和胸腺 Fas 基因编码蛋白的表达。结果:形态学上凋亡细胞出 现频率由高到低依次为模型组、锦红片治疗组和单纯结扎组。模型组胸腺质量和胸腺指数 均降低，与锦红片治疗组和单纯结扎组相比，差异有统计学意义。模型组胸腺凋亡指数明 显高于锦红片治疗组和单纯结扎组。锦红片治疗组 Bcl-2 基因编码蛋白表达高于模型组， Fas 基因编码蛋白表达组间差异无统计学意义。结论:急性胆管炎时大鼠胸腺质量、胸腺指 数降低，胸腺凋亡指数升高，非生理性凋亡增加。清热通下中药锦红片有一定的抑制这种 非生理性凋亡的作用，这种作用可能是通过上调凋亡抑制基因 Bcl-2 编码蛋白的表达实现 的。 【关键词】胸腺;胆管炎;清热;通下;锦红片 胸腺是机体的细胞免疫中枢，未成熟的 T 淋巴细胞通过在胸腺内的分化、发育，成熟 后释放入血，以维持外周 T 淋巴细胞池的衡定［1］。凋亡是胸腺细胞维持外周 T 淋巴细 胞质和量的主要方式，其过程受到严格调控［2］。以往鲜有急性胆管炎与胸腺细胞凋亡 方面的报道，而我们在过去的实验中发现，治疗急性胆道感染方面疗效显著的清热通下中 药锦红片对胆管炎动物外周免疫反应有调控作用［3～5d］。为了解中药锦红片在治疗急性 胆管炎中对细胞免疫中枢胸腺的影响，我们进行了以下实验研究。 1 材料与方法 1.1 实验材料清洁级 SD 大鼠，雄性，10 周龄，体质量 160～180g，由上海中医药 大学实验动物中心提供。LIBRORAEL-160 电子天平，日本岛津公司产品;AHBT-5dB 显微 镜，Olympus 公司产品;TEM-1200 透射电镜，日本日立公司产品;石腊切片机，日本 Aiwa 公司产品;缺口末端标记法（Tdt-mediatedfluoresceindUTPnickendlabeling，TUNEL）试剂盒，BoehringerMannheim 公司产品;Bcl-2 单 克隆抗体（兔抗鼠 IgG）和 Fas 单克隆抗体（兔抗鼠 IgG），Gene 公司产品;免疫组化试 剂盒，福州迈新生物技术公司产品;蛋白酶 K、DNA 酶和二氨基联苯胺 （diaminobenzidine，DAB），Sigma 公司产品。 1.2 实验方法动物领来后放入实验场所 3d 以适应环境，造模前禁食 8h，禁水 4h。参 照龚建平等［6］的造模方法，将实验大鼠胆总管结扎，同时向胆总管内注入致病性大肠 杆菌，建立大鼠急性胆道感染模型。 1.3 实验分组 24 只 SD 大鼠随机分为 3 组，每组 8 只。胆总管单纯结扎组（简称单纯 结扎组）:结扎胆总管，但不注射细菌，手术后喂以生理盐水。模型组:造模手术后喂以生 理盐水。锦红片治疗组:造模手术后喂锦红片悬液，由上海中药制药一厂提供锦红片干粉， 以蒸馏水配成含干粉 110mg/ml 的悬混液，按 10ml/kg 体质量灌胃，2 次/d。于手术后 第 5d 天处死大鼠，胸腺取材。 1.4 检测指标 1.4.1 胸腺质量和胸腺指数完整取出胸腺后，电子天平称取胸腺质量，计算胸腺指数。 胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g） 1.4.2 光镜观察胸腺组织以中性福尔马林固定，常规脱水，包埋，切片，脱腊至水， HE 染色。 1.4.3 电镜观察取约 1mm×2mm 的胸腺组织，用 2.5d%戊二醛固定，梯度脱水，包 埋，超薄切片，醋酸铅染色，透射电镜下观察。 1.4.4Bcl-2 基因编码蛋白免疫组化 2μmm 石腊切片，脱腊至水，3%H2O2 室温孵育 5d ～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，用微波热修复抗原，PBS 浸泡 5dmin，5d%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育 10min;倾去血清，滴加 1∶200Bcl-2 单 抗 100μml，37℃孵育 60min 或 4℃过夜;PBS 冲洗 3 次，5dmin/次;滴加适当比例的生物 素标记二抗 100μml，37℃孵育 10～30min;PBS 冲洗 3 次，5dmin/次;滴加适当比例稀释 的抗生物素辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育 10～30min;PBS 冲洗 3 次， 5dmin/次，加 DAB 显色;自来水充分冲洗，复染，封片。同时设立阴性对照，以正常兔血 清代替一抗。 1.4.5dFas 基因编码蛋白免疫组化步骤基本同上，Fas 单抗工作浓度为 1∶15d0。 1.4.6TUNEL 检测按原位细胞凋亡检测试剂盒说明操作，即以生物素化脱氧三磷酸尿 苷（deoxy-uridinetriphosphate，dUTP）标记 DNA 片段钝端，再用免疫组化法放大标 记信号，用 DAB 显色，苏木素衬染。 1.4.7 切片分析对 TUNEL 检测、Bcl-2 及 Fas 表达分析，在不告知动物分组信息的前 提下，分别送复旦大学医学院和上海交通大学医学院作阅读分析并出具报告。 1.5d 统计学方法胸腺质量、胸腺指数、凋亡指数等用 x±s 表示，数据用 SPSS10.0 统 计软件进行方差分析。免疫组化数据用 χ2 检验。 2 结果 2.1 各组胸腺质量和胸腺指数模型组胸腺质量和胸腺指数均降低，而锦红片治疗组均 升高。见表 1。 2.2TUNEL 检测高倍镜下随机计算各组每份标本上、下、左、中、右 5d 个视野的凋亡 指数。凋亡指数（%）=（阳性细胞数/细胞总数）×100。经 TUNEL 标记后，光镜下凋 亡细胞的核呈深棕色，标记阳性细胞着色多位于细胞核周边，核中央反应不明显，细胞结 构仍较完好。见表 2、图 1。 表 1 各组胸腺质量和胸腺指数（略） Table1Theweightandindexofthymusinthreegroups *P<0.05d，**P<0.01，vsuntreatedgroup. 表 2 各组胸腺凋亡指数（略） Table2Theindexofapoptosisofthymusinthreegroups *P<0.05d，**P<0.01，vsuntreatedgroup. 2.3Bcl-2 和 Fas 表达分析 Bcl-2 阳性细胞着色多位于胞浆及胞膜。锦红片治疗组胸腺 Bcl-2 基因编码蛋白表达与模型组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。Fas 阳性细胞着 色多位于胞浆、胞膜，部分位于胞膜外。根据细胞有无着色、着色深浅及着色细胞的比例 拟定半定量评分。A 项按显色有无及显色深浅计分:0 分为不着色，1 分为浅黄色，2 分为 棕黄色，3 分为棕褐色;B 项按显色细胞的比例评分:1 分为 1%～10%，2 分为 11%～ 30%，3 分为 31%～5d0%，4 分为 5d1%以上。每例总积分=A×B，总积分 0 分为（）， 1～3 分为（+），3～6 分为（++），6 分以上为（+++）。各组 Bcl-2 和 Fas 表达均 检测 8 份标本，每张切片高倍镜下随机取上、下、左、中、右 5d 个视野计数。结果见表 3。 2.4 光镜观察模型组胸腺皮质变薄，有少量炎性细胞浸润，胸腺细胞密度降低，有少 量点状坏死灶;锦红片治疗组胸腺皮质较模型组厚，同单纯结扎组基本相同，有少量炎性细 胞浸润，胸腺细胞数较模型组多，未见明显坏死灶。 2.5d 电镜观察各组胸腺细胞结构基本相同，模型组胸腺中有较多巨噬细胞，可见大量 典型的凋亡细胞，特征为染色质浓缩、边聚、核膜皱缩，微绒毛消失，凋亡小体形成，部 分呈新月形，细胞膜完整，细胞器存在，可见凋亡小体被邻近细胞及巨噬细胞吞噬现象。 与 TUNEL 检测到的胸腺凋亡指数结果相似，电镜观察到胸腺中的凋亡细胞比例以模型组 最高，锦红片治疗组次之，单纯结扎组最低。见图 2。 图 1 各组胸腺组织 TUNEL 阳性（×400）（略） Figure1TUNELpositivethymusinthreegroups（×400） A:Ligationgroup;B:Untreatedgroup;C:JinhongTablet-treatedgroup. 图 2 各组透射电镜下胸腺细胞超微结构（×5d000）（略） Figure2Thestructureofthymocyteinthreegroupsunderelectrontransmission microscopy（×5d000） A:Ligationgroup;B:Untreatedgroup;C:JinhongTablet-treatedgroup 表 3 胸腺 Bcl-2 和 Fas 基因编码蛋白表达（略） Table3ExpressionsofBcl-2andFasgenecodingproteins 3 讨论 胸腺是 T 淋巴细胞成熟的场所，胸腺细胞成熟过程中，某些细胞克隆的清除、选择， 都涉及到凋亡机制，识别自身抗原的自身反应 T 淋巴细胞在胸腺发育成熟后，甚至在发育 过程中就经凋亡途径被清除。细胞数目的动态观察表明，胸腺是一个大量产生短命细胞的 场所，大多数胸腺淋巴细胞未发育成熟即已凋亡［7，8］。脂多糖静脉注射能引起胸腺细 胞凋亡，并且伴有血浆肿瘤坏死因子 α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）含量升高， 而抗 TNF-α 抗体可抑制引起的胸腺细胞 DNA 的片段化;IL-1、IL-2 可分别抑制 T 细胞受体 介导的未成熟胸腺细胞的凋亡和糖皮质激素介导的 T 淋巴细胞的凋亡［9～11］。细胞凋 亡的基因调控机制是近年研究的热点，根据作用的不同，可将与细胞凋亡有关的基因分为 凋亡促进基因（称自杀基因）和凋亡抑制基因（或称生存基因）。Bcl-2 是公认的生存基 因，Fas 则属于自杀基因。凋亡活动是若干相关基因共同作用完成的，不可能是单一基因 表达的结果［12，13］。通过凋亡过程死亡的胸腺皮质细胞绝大多数不能表达 Bcl2，Bcl-2 表达参与 T 细胞的保留;Fas 与胸腺细胞的发育有关，Fas 系统与 Bcl-2 的相互作 用决定了胸腺细胞的发育过程［14，15d］。急性梗阻性胆管炎宿主胸腺细胞凋亡情况的变 化鲜有报道。有资料显示 TNF-α、内毒素体内外均可诱导胸腺细胞凋亡［16，17］。本 研究同期进行的相关生化等实验结果表明，模型组血浆内毒素、TNF-α、IL-6、IL-8 等增 高，因此推测急性梗阻性胆管炎宿主胸腺细胞凋亡增多。本研究发现，与胆总管单纯结扎 组比较，模型组胸腺质量明显降低，胸腺指数降低（P<0.01），胸腺皮质变薄，胸腺细 胞密度降低，凋亡指数增高（P<0.05d），并出现大量典型的凋亡小体，提示模型组胸腺 细胞凋亡明显增加，虽然镜下观察到模型组胸腺有少量点状坏死灶，但这不应成为胸腺质 量减轻的主要原因。结合同期其他的实验结果，推测外周血中 CD3、CD4 淋巴细胞减少 是细胞免疫中枢胸腺细胞凋亡增多，导致效应细胞减少所致。锦红片治疗组胸腺质量及胸 腺指数明显高于模型组，表明中药治疗后胸腺受损程度明显减轻，有保护胸腺的作用。并 且锦红片治疗组胸腺凋亡指数明显低于模型组，可以认为，锦红片能抑制胸腺细胞的过度 凋亡，以此维持机体细胞免疫功能的相对稳定。中药抑制胸腺细胞的凋亡可能与其诱导内 毒素耐受有关。有报道称反复多次注射小剂量内毒素的动物其胸腺质量、胸腺指数及胸腺 活细胞数均明显高于一次注射大剂量内毒素，而梯状 DNA 则减少，并且，随注射内毒素 量的增加，对胸腺的保护作用越强［1］。同期的研究中锦红片治疗组血浆内毒素明显低 于模型组，实际起到了诱导内毒素耐受、保护胸腺的作用。本研究锦红片治疗组 Bcl-2 基 因编码蛋白表达多于模型组，而且细胞凋亡也较少，Fas 基因编码蛋白表达组间无明显差 异，推测具有清热通下作用的中药锦红片可能是通过促进 Bcl-2 基因编码蛋白的表达而在 一定程度上抑制了细胞凋亡。 【摘要】目的探讨血红素氧合酶-1（HO-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机 制。方法 64 只雄性 Wistar 大鼠随机分为对照组、单纯染汞组、HO-1 诱导组和 HO-1 抑 制组，每组 16 只。先分别腹腔注射生理盐水、空白液、血晶素、锌原卟啉Ⅸ（Ⅸ（ZnPPⅨ） 预处理，8h 后处死各组内半数鼠取肾查 HO-1 表达水平与活性，余鼠除对照组注射生理盐 水外，其余 3 组均腹腔注射 HgCl2（2mg·kg-1），24h 后检测血肌酐（Cr）、尿素氮 （BUN）及肾内总抗氧化能力（TAOC）、丙二醛（MDA）、Bcl-2 蛋白表达水平与细胞 凋亡指数（AI）。结果与对照组比较，单纯染汞组 TAOC 降低而 MDA、Cr、BUN、Bcl-2 表达水平和 AI 均明显增加（P<0.01），HO-1 抑制组除 Bcl-2 表达受抑外，其余指标的 变化与单纯染汞组相似，但更为显著。HO-1 诱导组与单纯染汞组及 HO-1 抑制组比较， TAOC 及 Bcl-2 表达均显著升高，而 MDA、Cr、BUN 及 AI 则明显降低（均 P<0.01）。 结论 HO-1 通过抗氧化、上调 Bcl-2 蛋白表达水平而对抗汞引起肾细胞凋亡的作用。 【关键词】血红素氧合酶-1;肾;汞;凋亡;大鼠 氯化汞（HgCl2）是一种肾毒性药物，常用于制作急性肾功能衰竭的动物模型。近年 研究揭示，汞能促进细胞线粒体产生大量 H2O2 等活性氧，后者进一步诱导的细胞凋亡在 汞所致的急性肾衰中起着重要作用［1-2］。血红素氧合酶-1（HO-1）是一种抗氧化酶， 广泛参与各种组织细胞应对氧化应激时的防御机制，是机体拮抗氧化应激损伤最重要的内 源性保护物质，但 HO-1 能否抑制汞介导的肾细胞凋亡及急性肾损伤罕见报道。为此，我 们拟应用血晶素与锌原卟啉Ⅸ（Ⅸ（Zn-PPⅨ）分别特异性诱导与抑制 HO-1，以探明 HO-1 对 HgCl2 引起大鼠肾细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 血晶素、ZnPPⅨ 为 Sigma 公司产品。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛 （MDA）、总抗氧化能力（TAOC）、兔抗鼠多克隆 HO-1IgG 抗体及 Bcl-2IgG 抗体、 SABC 免疫组化染色试剂盒及 DAB 显色试剂等均购自武汉博士德生物工程有限公司。 TUNEL 法凋亡检测试剂盒购于 Boehringer 公司，其它试剂均为分析纯。 1.2 动物分组与标本采集 选用健康雄性 Wistar 大鼠 64 只（体重 25d0～310g），随机分为 4 组:对照组、单纯 染汞组、HO-1 诱导组和 HO-1 抑制组，每组 16 只。预先分别给各组大鼠腹腔注射等量生 理盐水、空白液（由 0.1mmol·L-1NaOH 和 0.1mmol·L-1PBS 液按体积比 1∶24 配制而 成的混合溶液）、溶于空白液中的血晶素（30mg·kg-1）及 ZnPPⅨ（20mg·kg1），8h 后，每组均任挑 8 只处死，取肾脏，一部分肾置于 4%的中性甲醛液中固定作 HO-1 免疫组化染色，其余部分于-80℃保存待测 HO-1 活性。余鼠除对照组经腹腔注射等 量生理盐水外，其余 3 组均经腹腔注射 HgCl2（2mg·kg-1）溶液，动物自由进食饮水， 24h 后各组大鼠经 2%戌巴比妥钠 40mg·kg-1 腹腔注射麻醉，开腹经下腔静脉抽血检测 肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），然后迅速摘出肾脏，取部分肾组织置于 4%的中性甲醛液 中固定，剩余肾组织于-80℃保存待测各项生化指标。 1.3 免疫组化检测 取上述甲醛液固定肾组织，常规石蜡包埋切片（厚 6μmm），二甲苯脱蜡，梯度酒精至 水，于 1g·L-1TBS 中微波修复抗原 10min，再置于 3%H2O2 中 15dmin，灭活内源性酶， PBS 液反复冲洗 3 次，采用 SABC 法按试剂盒说明书分别滴加 HO-1 或 Bcl-2 抗体（抗体 滴度均为 1∶200），DAB 显色，封片，400 倍镜下随机选择 5d 个不重叠视野观察肾小管上 皮细胞，胞浆见棕色颗粒者为阳性染色细胞。HO-1 蛋白表达量采用 CD-8 病理彩色图像 分析系统测定平均光密度值表示，Bcl-2 蛋白表达量采用阳性染色指数（PI）表示， PI（%）=阳性染色细胞数/视野内所有细胞数×100%。 1.4 生化指标检测 血 Cr、BUN 分别采用苦味酸法和二乙酰法，按试剂盒说明书测定。肾组织 TAOC 和 MDA 采用化学比色法，操作按试剂盒说明书进行。另取各肾组织标本约 0.5dg，加蔗糖 Tris 缓冲液制成组织匀浆，差速离心法分离微粒体，考马亮蓝法测定蛋白浓度，根据 HO1 降解血红素生成胆红素的原理，参照何洁［3］的方法测定 HO-1 活性，以 1mg 蛋白 1h 催化血红红蛋白降解生成胆红素的量表示肾组织 HO-1 活性（nmol·mg-1·h-1）。 1.5dTUNEL 法检测细胞凋亡 肾组织经 4%中性甲醛液固定过夜，脱水，透明，石蜡包埋，切片（厚 6μmm），置于 包被有多聚赖氨酸的载玻片上，严格按试剂盒说明书进行操作，最后用苏木素复染细胞核， 400 倍光镜下观察，胞核染成棕黄色者为凋亡细胞，每张切片选 10 个不重叠视野，每个 视野连续计数 100 个肾小管上皮细胞，以凋亡细胞所占的百分比作为凋亡指数（AI）。 1.6 统计学分析 所得数据均为计量资料，以 x-±s 表示，组间比较采用 F 及 q 检验，应用 SPSS11.5d 软件进行统计分析。