人肝癌细胞凋亡影响半胱氨酸蛋白酶论文

【摘要】研究日本新近研制的第三代 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（3-hydroxy-3methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）还原酶抑制剂匹伐他汀（还原酶抑制剂匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）还原酶抑制剂匹伐他汀（ 对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶 3（caspase-3）还原酶抑制剂匹伐他汀（活性的影响。方法:采用细胞培养技 术，以肝癌细胞系 HepG2 为靶细胞，以不同浓度的药物处理细胞 48hh 后，利用 WST-8h 法测定 NK-104 对细胞增殖的影响;利用荧光染料 Hoechst33258h 染色，荧光显微镜观察 细胞核碎片;以流式细胞仪分析细胞周期的变化;采用半胱氨酸蛋白酶 3 比色法检测 caspase-3 活性。结果:NK-104（10μmol/Lmol/L）还原酶抑制剂匹伐他汀（对 HepG2 细胞有明显抑制作用，可诱导 HepG2 细胞凋亡，并能增强 caspase-3 基因的活性。结论:NK-104 能够诱导 HepG2 细 胞凋亡，其机制与 caspase-3 依赖性凋亡调节信号通路有关。 【关键词】肝癌 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）还原酶抑制剂匹伐他汀（还 原酶抑制剂，统称为抑制素，是重要的脂类合成抑制剂，主要在人体肝脏中代谢，临床上 广泛应用于治疗高脂血症［1］。最近研究发现，HMG-CoA 还原酶抑制剂具有生物学多 效性，与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用［2］、体内与 5 氟尿嘧啶 （fluorouracil，5-Fu）还原酶抑制剂匹伐他汀（共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他汀 （pitavastatin，NK-104）还原酶抑制剂匹伐他汀（是日本新近研制的第三代高效 HMG-CoA 还原酶抑制剂 ［4］。在血管内皮细胞系 NK-104 通过磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB，PI3K-Akt）还原酶抑制剂匹伐他汀（基因激活途径对内皮细胞 的保护作用已有报道［5］，但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞 系 HepG2 通过 2-（2-甲氧基-4-硝基苯）还原酶抑制剂匹伐他汀（-3-（4-硝基苯）还原酶抑制剂匹伐他汀（-5-（2，4-二硫代苯）还原酶抑制剂匹伐他汀（-2H-四 氮唑单钠盐｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）还原酶抑制剂匹伐他汀（-3-（4-nitrophenyl）还原酶抑制剂匹伐他汀（-5-（2，4disulfophenyl）还原酶抑制剂匹伐他汀（-2H-tetrazolium，monosodiumsalt］，WST-8h｝、荧光染料 Hoechst33258h 染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶 3 比色法等检测方法，研究 NK-104 对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶 3（caspase-3）还原酶抑制剂匹伐他汀（活性的影响，为 NK-104 在抗肿瘤 中的作用机制提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 主要材料与仪器 NK-104，日本兴和有限公司（日本名古屋）还原酶抑制剂匹伐他汀（和日产化学工业公 司（日本东京）还原酶抑制剂匹伐他汀（产品;荧光染料 Hoechst33258h、甲羟戊酸（mevalonicacid，MEV）还原酶抑制剂匹伐他汀（和 碘化丙啶（propidiumiodide，PI）还原酶抑制剂匹伐他汀（染色液（PI100g/L，1%Triton100，9g/ LNaCl）还原酶抑制剂匹伐他汀（，Sigma 公司产品。流式细胞仪，2000FCA，美国 BD 公司产品。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养人肝癌细胞株 HepG2（美国 ATCC 公司产品）还原酶抑制剂匹伐他汀（在含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基、5%CO2、37℃条件下培养。实验中，细胞种植于适当培养皿中，90% 的细胞融合时，用磷酸盐缓冲液洗净后，加入适量含有 NK-104 和 MEV（1mmol/L）还原酶抑制剂匹伐他汀（等 药物的培养液，37℃培养箱中培养。 1.2.2WST-8h 方法利用 WST-8h 试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG2 细胞（1×104 个细胞/孔）还原酶抑制剂匹伐他汀（接种于含 100μmol/Ll 培养液的 96 孔培养板中，NK-104（0.1～100μmol/Lmol/L）还原酶抑制剂匹伐他汀（治 疗 48hh 后，分别加入 WST-8h 试剂 10μmol/Ll（日本同仁化学研究所）还原酶抑制剂匹伐他汀（培养 2h 后，选择 450nm 波长，测定各孔的吸光度 OD 值。 1.2.3Hoechst33258h 染色细胞经药物刺激 48hh 后，甲醇-冰乙酸（3∶1）还原酶抑制剂匹伐他汀（细胞固定液 4℃固定 5min，磷酸盐缓冲液稍洗后，点加 Hoechst33258h 染色液，10min。用滤纸沾 去多余液体，封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。 1.2.4 流式细胞仪检测凋亡峰在室温下将刺激 48hh 后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤 2 次，并在适当的染色缓冲液中吸取 100μmol/Ll 的细胞（1×105）还原酶抑制剂匹伐他汀（至试管中。加入 200μmol/LlRNaseA，37℃水浴 30min，再加 8h00μmol/LlPI 染色液混匀，4℃避光 30min 后，立 即上机分析。 1.2.5 半胱氨酸蛋白酶 3 比色法经药物治疗 48hh 后收集细胞，采用半胱氨酸蛋白酶 3 比色法试剂盒按照厂家说明进行测定 （Medical&BiologicalLaboratoriesCo.，LTD，Japan）还原酶抑制剂匹伐他汀（。 1.3 统计学方法数据均以 x±s 表示，采用 SPSS11.0 统计软件进行统计分析，采用 t 检验。 2 结果 2.1NK-104 对 HepG2 细胞增殖的抑制作用为了确定 NK-104 在人肝癌细胞 HepG2 中的治疗浓度，采用 WST-8h 方法对细胞的增殖作用进行测定。与对照组相比，NK-104 在 10 和 100μmol/Lmol/L 时，对 HepG2 细胞生长均有明显的抑制作用。100μmol/Lmol/L 时，近 50%的细胞死亡（P<0.01）还原酶抑制剂匹伐他汀（。见图 1。 图 1 不同浓度 NK-104 对 HepG2 生长的抑制作用（略）还原酶抑制剂匹伐他汀（ Figure1GrowthinhibitionofHepG2cellsbyNK-104 **P<0.01，vscontrolgroup. 2.2NK-104 诱导细胞凋亡的形态变化对照组细胞界限清晰，胞浆丰富，细胞核呈弥散、 均匀荧光分布，经 10～100μmol/Lmol/LNK-104 处理后，HepG2 发生细胞凋亡，细胞核或细 胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒及明显核形态变化。见图 2。 2.3NK-104 对 HepG2 细胞周期的影响与对照组相比，NK-104 治疗组可明显诱导 HepG2 的细胞凋亡，出现相当比例的 DNA 含量小于二倍体的亚 G1 凋亡峰（24%）还原酶抑制剂匹伐他汀（，不 同周期细胞的比例也发生变化，与 MEV 共同作用后可消除 NK-104 的这种诱导作用。见 图 3。 2.4NK-104 对 caspase-3 活性的影响与对照组相比，NK-104 可明显诱导 caspase3 活性（P<0.01）还原酶抑制剂匹伐他汀（，同样加入 MEV 能够消除 NK-104 的这种诱导作用。见图 4。 图 2NK-104 处理 48hh 后 HepG2 细胞核的形态变化（Hoechst33258h 染色， ×400）还原酶抑制剂匹伐他汀（（略）还原酶抑制剂匹伐他汀（ Figure2NuclearmorphologyoftheHepG2cellstreatedbyNK104for48hhours（Hoeschst33258hstaining，×400）还原酶抑制剂匹伐他汀（ A:Control，normalnuclearstructure;B:NK-10410μmol/Lmol/L;C:NK-104100μmol/Lmol/ L;●:Cytoplasmicchange;■:Nuclearfragmentation. 图 3NK-104 治疗 HepG2 细胞后细胞周期分布变化（略）还原酶抑制剂匹伐他汀（ Figure3CellcycleanalysisofHepG2cellstreatedbyNK104（PercentageofSubG1cells）还原酶抑制剂匹伐他汀（ **P<0.01，vscontrolgroup.A:Control;B:NK-10410μmol/Lmol/L;C:NK-104+MEV. 图 4NK-104 对 caspase-3 活性的影响（略）还原酶抑制剂匹伐他汀（ Figure4NK-104inducedactivityofcaspase-3 **P<0.01，vscontrolgroup.TheHepG2cellswereexposedtoNK-104（10μmol/Lmol/ L）还原酶抑制剂匹伐他汀（alone，orNK-104（10μmol/Lmol/L）还原酶抑制剂匹伐他汀（plusMEV（1mmol/L）还原酶抑制剂匹伐他汀（for48hhours.Thecaspase3activitywasmeasuredwithacolorimetricproteaseassay. 3 讨论 目前认为恶性肿瘤是一种多基因异常的疾病，其发生的分子基础是原癌基因的激活或 抑癌基因的突变失活或缺失，导致某些细胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成肿瘤。 原发性肝癌约 55%发生在中国［6］。肝癌细胞的凋亡在肝癌的发生发展、转归及治疗等 方面均有重要的意义。HMG-CoA 还原酶抑制剂，是重要的脂类合成抑制剂，临床上广泛 应用于治疗高脂血症。最近研究表明，HMG-CoA 还原酶抑制剂具有抗感染、降低炎性细 胞因子水平及抗癌等生物学多效性作用。Otsuki 等［7］报道 1～30μmol/Lmol/L 的西米伐他 汀（simvastatin）还原酶抑制剂匹伐他汀（具有预防癌症的作用。Sutter 等［8h］研究认为 1～10μmol/Lmol/L 的弗鲁 伐他汀（fluvastatin）还原酶抑制剂匹伐他汀（通过诱导 Huh7 细胞凋亡而抑制肝癌细胞的增殖。Denoyelle 等 ［9］认为 25μmol/Lg/L 的赛里伐他汀（cerivas-tatin）还原酶抑制剂匹伐他汀（对 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞通过 抑制细胞核因子 κBB 活性起到重要的抗转移作用。HepG2 细胞具有典型肝癌细胞的一系列 恶性特征，是研究和评价防治肝癌药物的较理想的细胞模型。NK-104 是日本新近研制的 第三代 HMG-CoA 还原酶抑制剂，具有副作用小、高效和强力的药代动力学特点［4］。 我们的研究结果表明，NK-104 对 HepG2 细胞增殖有明显抑制作用，其最大抑制率可达 50%左右，使 HepG2 细胞呈现典型的凋亡形态学特征，核质浓集，有凋亡小体。提示 NK-104 能在一定程度上抑制肝癌细胞的增殖。流式细胞术具有检测的细胞数量大、反映 群体细胞的凋亡状态比较准确等优点［10］。NK-104 作用于 HepG2 细胞后，通过流式 细胞仪分析，与对照组相比，可见凋亡细胞出现在直方图亚二倍体峰位置，并与细胞主峰 G0/G1 分界清楚，可定量凋亡占整个细胞群百分比。本研究结果表明，NK-104 可明显诱 导 HepG2 细胞凋亡。细胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase）还原酶抑制剂匹伐他汀（，其中研 究最多，功能相对较明确的为 caspase-3。caspase-3 是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶 之一，为凋亡的效应分子，被称为凋亡的“执行者”［11～13］。激活的 caspase-3 可裂 解相应的胞核内底物 DNA 修复酶（polyADP-ribosepolymerase，PARP）还原酶抑制剂匹伐他汀（，使 PARP 失去对 DNA 的修复功能，导致细胞转向凋亡［14］。本研究表明，10μmol/Lmol/LNK-104 能 够增强 caspase-3 的活性，加入 MEV 能够消除 NK-104 的这种诱导作用。这一研究结果 表明，NK-104 诱导 HepG2 细胞凋亡与激活 caspase-3 依赖性凋亡调节信号通路有关。 【关键词】胆囊 胆石病是一种全球性、多发性、难愈性疾病，在我国胆石病患病率约为 7%～10%， 而且随着人口的老龄化、饮食结构的改变及静脉营养的推广，其发病率还在逐年上升 ［1］。但胆石病发病原因迄今仍未完全阐明。近 10 年中，糖尿病并发胆石病的患者越来 越多，因此胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）还原酶抑制剂匹伐他汀（与胆石病的关系研究越来越受到重视。 本文就这一方面的研究作一综述。 1 中医和西医对胰岛素抵抗和胆石病相关性认识 胆结石分为胆固醇结石和胆色素结石。近年发现，我国以胆固醇作为主要成分的结石 已成为结石的主要类型［2，3］。肥胖、女性、多产、家族史为主要危险因素，新的危险 因素仍被不断发现。例如，减肥、高能量饮食的摄入、缺乏运动已加入危险因素之列。近 年来，糖尿病患者合并胆石病呈上升趋势。糖尿病属于代谢性疾病，多伴有脂代谢等多方 面的紊乱，病机以阴虚为主。而近年研究表明，胆石病病机也以阴虚多见。朱培庭等 ［4］对临床上 274 例慢性胆道感染、胆石病进行的辨证分析发现，肝阴不足证型占 66.66%，并且 50 岁以上年龄患者高达 72.37%，这两者均与《内经》“年四十而阴气自 半也，起居衰矣”（《素问·阴阳应象大论》）还原酶抑制剂匹伐他汀（的理论及朱丹溪“阳常有余，阴常不足”之论相 吻合。2 型糖尿病临床上常有 IR 的证据，IR 是指机体靶组织对胰岛素反应性降低或丧失而 产生的一系列病理生理变化，其形成的机制十分复杂，多在复杂的遗传背景基础上由各种 环境因素诱导而产生，其中胰岛素信号转导障碍是导致 IR 形成的重要环节。胰岛素合成、 胰岛素与胰岛素受体（insulinreceptor，InsR）还原酶抑制剂匹伐他汀（结合到最终生理功能实现的一系列过程 发生的异常均可导致 IR［5，6］。198h8h 年，Reaven 将 2 型糖尿病及伴随的许多异常， 主要包括高胰岛素血症、高脂血症、肥胖、高血压等概括为胰岛素抵抗综合征。Haffner 等［7］认为 IR 是胰岛素抵抗综合征的最根本缺陷。现国际上较为通用的胰岛素抵抗诊断 指标是采用 Defronzo1979 年建立的应用正常血糖胰岛素钳夹技术直接测出的葡萄糖代谢 速率。此外，国内李光伟等［8h］提出了一个用于流行病学研究的便于临床应用的新的胰 岛素敏感指标，即空腹胰岛素与空腹血糖乘积的倒数。现已确认 IR 是引起脂质代谢紊乱的 重要机制，而脂质代谢紊乱是导致胆固醇结石形成的重要原因也已成共识，IR 与胆固醇结 石存在非常密切的联系，IR 可能在胆固醇结石形成过程中起着重要作用［9］。总之，中 医中“阴虚”的共性，西医中胰岛素水平和脂代谢在胆固醇结石形成过程中的作用，均揭示 了 IR 与胆石病的密切相关性。 2 胰岛素抵抗和胆石病临床相关性的研究 2.1 空腹胰岛素、C 肽等物质在胆石病患者中的改变早在 30 多年前，Sampliner 等 ［10］在流行病学研究中就发现，具有高胰岛素血症的 Pima 印第安人胆石症发生率极高， 提示高胰岛素血症可能与胆石症的发生有关。Scragg 等［11］首先研究血浆胰岛素水平 与胆囊结石危险性关系，并发现在两组胆结石患者中，空腹胰岛素水平均较对照组高，且 为独立于年龄、肥胖程度及血浆甘油三酯水平的危险因素。1990 年 Laakso 等［12］对 糖尿病患者进行配对病例对照研究发现，与按性别、年龄、体质量指数、糖尿病病程及代 谢控制水平等因素严格配对的无胆囊疾病的对照组进行比较，胆囊结石组空腹胰岛素水平 明显增高。Ruhl 等［9］在 2000 年第三次全美健康与营养调查研究中探讨了胰岛素与胆 石病的关系，结果显示未诊断为糖尿病人群的空腹血清胰岛素、C 肽水平等 IR 相关指标与 胆结石患病率之间呈正相关。Misciagna 等［13］在一个病例对照研究中也发现，经控制 了性别、年龄、体质量指数、血糖及血脂之后，临床未诊断糖尿病及空腹血糖正常的个体 中，高胰岛素血症与胆囊结石发病有关，提示 IR 是胆结石形成的重要危险因素。IR 不仅 是糖尿病的重要发病基础，而且在胆结石形成中起关键作用，是胆结石发生的重要危险因 素［9］。糖尿病患者胆结石的发病率与一般人群相比显著增高。曾有文献报告，糖尿病 患者胆石症的发病率为 30.2%，非糖尿病患者的发病率为 11.6%［14］。另外，有研究 发现糖尿病患者使用胰岛素可增加胆汁的胆固醇饱和度，从而促进结石的形成［15］。用 胰岛素治疗的 2 型糖尿病患者较未用胰岛素者胆囊结石的发生率增加［16］。有关糖尿病 合并胆石病的发病机制研究显示，糖尿病合并胆石病患者较糖尿病无胆石病患者的空腹胰 岛素、C 肽水平明显升高，胰岛素敏感指数明显降低［17～20］。另有回顾性分析研究分 别测定 2 型糖尿病伴胆结石组患者与不伴胆结石组患者的血清胰岛素、C 肽，并进行差异 性比较，亦发现前组患者空腹血清胰岛素、C 肽较后组显著增高（P<0.05）还原酶抑制剂匹伐他汀（，说明高胰 岛素血症可能是 2 型糖尿病合并胆结石的危险因素［21～23］。还有研究发现血清瘦素 可能与 2 型糖尿病人胆结石的形成有关，2 型糖尿病人的血清瘦素水平也是胰岛素抵抗的 一个预测指标［24］。此外对于 2 型糖尿病合并胆石症者和不合并胆石症者比较而言，前 者伴有明显的高胰岛素血症（P<0.05）还原酶抑制剂匹伐他汀（，从而证实 2 型糖尿病合并胆石症组较不合并胆 石症组存在明显的高胰岛素血症和 IR，说明其间存在相关性［25，26］。韦秀英等 ［27］对 2 型糖尿病胆石症与无胆石症患者共 113 例作临床对照研究，对其有关的危险 因素进行了相关性分析，发现前组血清胰岛素水平明显升高，而血脂、血糖、糖化血红蛋 白、病程两组差异均无统计学意义，说明高胰岛素血症与胆结石的发生密切相关，而血糖 浓度与胆结石的发生无关。 2.2 脂质代谢在糖尿病合并胆石病患者中的改变樊力红等［28h］、李仁达等［29］及 魏敬等［30］在 90 年代进行非胰岛素依赖型糖尿病胆结石的血脂研究，表明脂肪代谢异 常和 IR 在非胰岛素依赖型糖尿病患者的胆结石形成过程中可能起重要作用。糖尿病患者较 非糖尿病患者更易患胆结石，胆石病是糖尿病常见的并发症之一。王仲祥等［31］报道， IR 是 2 型糖尿病的重要特征，糖尿病合并胆结石患者除空腹血胰岛素水平明显升高外，且 与血清总胆固醇浓度呈正相关，提示脂质代谢紊乱是促进 2 型糖尿病胆结石形成的一个独 立危险因素。李亚等［32］采用病例对照研究的方法，在控制了性别、年龄、血脂等混杂 因素后，观察 2 型糖尿病伴胆囊结石组及不伴胆囊结石组各 40 例，结果发现前者胆固醇 明显升高（P<0.05）还原酶抑制剂匹伐他汀（，说明前者比后者具有更明显的 IR，也证实胆囊结石存在 IR。黄道 林等［33］观察比较了 2 型糖尿病合并胆石症 103 例与不合并胆石症 56 例患者血清中相 关指标的差异，发现前者以女性居多，既往高峰体质指数和血液中甘油三酯水平明显高于 无胆石组;而年龄、病程、血糖等差异无统计学意义，从而证实 2 型糖尿病合并胆石症可能 与肥胖及脂质代谢紊乱有关，从某种程度上揭示了甘油三酯、载脂蛋白的增加是 2 型糖尿 病患者发生胆石症的危险因素。李英兰等［34］和王玉君等［35］通过测定老年 2 型糖 尿病合并胆结石患者及无胆结石的 2 型糖尿病患者的血脂水平并计算出胰岛素敏感指数， 发现前者该指标改变显著，说明血脂代谢异常可能是 2 型糖尿病老年患者胆结石形成的危 险因素。李蓉［36］对 145 例均符合糖尿病诊断的患者晨起采集空腹静脉血，测胆固醇、 甘油三酯、低密度脂蛋白，高密度脂蛋白，发现糖尿病伴胆结石患者占 32%，胆固醇升高 占 27.15%，甘油三酯升高占 29.16%，高密度脂蛋白降低占 24.18h%，低密度脂蛋白升 高占 10.13%，从而说明糖尿病脂代谢异常与胆结石的发生有密切关系。卜东明［37］通 过收集 161 例住院糖尿病患者的资料，就其伴胆囊炎、胆结石、脂肪肝情况与脂代谢异常 以及糖尿病病程、年龄等相关因素进行分析，抽样同期住院的 42 例非糖尿病患者进行对 比，发现糖尿病组上腹部 B 超检查阳性率明显高于非糖尿病组，糖尿病患者中 B 超阳性组 的血脂异常高于 B 超阴性组，亦明显高于非糖尿病组，说明糖尿病患者往往伴有胆囊炎、 胆结石和脂肪肝，其发生胫灰斐９叵得芮小灰斐９叵得芮小灰斐９叵得芮小?/P> 3 结语 IR 是近年来研究者关于胆石病病因的一种较新的观点，临床报道呈上升趋势;IR 的相 关指标有空腹胰岛素水平、C 肽、空腹血糖以及脂代谢的基本指标等。但已有的报道仅是 对这种相关性的一种简单证实，仍然缺乏具体、深入、大规模的试验来探索其作用的具体