透析五味保肝丸定性定量实验

摘要：目的建立五味保肝丸定性定量质量标准。方法薄层色谱法定性鉴别五味子和丹 参的存在，高效液相色谱法确定降酶丸中五味子甲素含量。结果定性鉴别五味子和丹参， 方法简便，图谱清晰；高效液相色谱法测定含量，结果准确，阴性无干扰。结论该实验方 法可作为降酶丸的定性定量质量标准指标。 关键词：五味保肝丸；薄层色谱；高效液相色谱；五味子甲素 五味保肝丸由五味子、丹参等中药组成，是我院传统中药自制制剂(鲁卫药制字 Z02080175))，具有敛阴、活血、降酶功效，用于乙型肝炎、转氨酶升高等病症，临床应 用近 30 年，疗效确切。为控制该制剂质量，除常规检测项目外，实验研究五味子、丹参 两味药的薄层色谱法鉴别方法，以及该制剂主要药效成分五味子甲素含量范围，为该制剂 质量控制指标提供定性定量实验依据。 1 主要仪器、试剂与药材 1.1 主要仪器 Agilent1100 型高效液相色谱仪(美国)，JA2003 型电子分析天平(上海)，KQ100 型 超声波清洗器(昆山)。 1.2 主要试剂 五味子甲素对照品(中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯(美国)，水为重蒸馏水， 其余试剂均为分析纯。 1.3 主要药材 五味保肝丸由本院制剂室提供，其他实验用药材取自本院中药库，经鉴定五味子为木 兰科植物五味子 Schisandchinensis(Turcz.)Bail 的干燥成熟果实，丹参为唇形科植物丹 参 SalviamiltiorrhizaBge.干燥根及根茎。阴性对照品实验时现制。 2 薄层色谱定性鉴别 2.1 五味子定性鉴别 取五味保肝丸 2g，研碎，加氯仿 30ml，超声提取 30min，滤过，滤液蒸干，残渣加 氯仿 1ml 使溶解，作为供试品溶液；另取缺五味子的处方比例量的其他药材细粉 2g，按 上述方法，制成五味子阴性对照液。再取五味子甲素对照品，加氯仿制成每 1ml 含 1mg 的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各 10μll，分别点于同一硅胶 GF25)4 薄层板 上，以石油醚(30℃～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15)：5)：1)的上层溶液为展开剂，展开，取 出，晾干。置紫外灯(365)nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显 相同颜色的斑点，五味子阴性对照液无此斑点。 2.2 丹参定性鉴别 取五味保肝丸 3g，研碎，加乙醚 20ml，超声处理 10min，过滤，滤液挥干，残渣加 甲醇 1ml 溶解，作为供试品溶液；另取缺丹参的处方比例量的其他药材细粉 2g，按上述 方法，制成丹参阴性对照液；再取丹参酮ⅡⅡ A 对照品，加甲醇制成每 1ml 含 0.5)mg 的溶 液，作为对照品溶液。吸取上述 3 种溶液各 10μll，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以苯- 醋酸乙酯(19：1)为展开剂，展开、取出、晾干。日光下检视，供试品色谱中，在与对照 品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，丹参阴性对照液无此斑点。 3 五味子甲素含量测定 3.1 色谱条件 色谱柱：AgilentODS 柱(4.6mm×15)0mm，5)μlm)。柱温：30℃，流动相：甲醇水(80：20)，流速：1.5)ml/min，检测波长：25)0nm。理论板数按五味子甲素计应不低 于 3000，五味子甲素峰与相邻峰分离度符合要求。 3.2 对照品溶液制备 精密称取减压干燥至恒重的五味子甲素对照品 6.32mg，加甲醇使溶解，并定容至 25)ml；制成浓度为 0.25)28mg/ml 的对照品溶液。 3.3 样品液制备 取五味保肝丸适量，粉碎过四号筛，置硅胶于干燥器中干燥 24h 后备用。取样品粉末 约 2g，精密称定，置 15)0ml 具塞三角烧瓶中，准确加入氯仿 5)0ml，称重，超声提取 40min，水浴温度 45)℃。提取液放至室温，再称定重量，用氯仿补足减失的重量，摇匀， 滤过，取续滤液 10ml，置水浴上蒸干，残渣加甲醇分次溶解定溶于 10ml 容量瓶中，得 样品液。 3.4 阴性对照溶液制备 取不含五味子的处方比例量的其他药材细粉，照“2.3”项方法制成阴性对照溶液。 3.5) 系统适应性试验 按“2.1”项下条件，将对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液分别进样 10μll 进行测 定，结果对照品溶液和供试品溶液色谱图在相应的保留时间处均有最大吸收峰，供试品溶 液相邻峰无干扰；阴性样品色谱图中，在与对照品色谱相应的保留时间处无色谱峰出现， 表明该制剂中其他组分对五味子甲素的测定无干扰。 3.6 线性关系考察 精密量取“2.2”步对照品溶液 2ml，加甲醇定容 10ml。分别准确吸取上述溶液 2.5)、5).0、10.0、15).0、20.0、30.0μll 依次进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面 积积分值为纵坐标，五味子甲素进样量(μlg)为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为:五味子 甲素 Y=2643.25)3X-3.75)6，r=0.9999(n=5))，线性范围 0.1264～1.5)168μlg。 3.7 精密度试验 精密吸取“2.2”步对照品溶液(浓度为 0.25)28mg/ml)2μll，按“2.1”色谱条件连续进样 5) 次，测定峰面积 RSD 为 1.42%(n=5))。精密度良好。 3.8 稳定性考察 精密吸取对照品溶液(浓度为 0.25)28mg/ml)2μll，分别于配制后 0、2、4、8、16、24h 进样，测定面积的 RSD 为 1.81%，表明供试品溶液在 24h 内稳 定。 3.9 重复性试验 精密称定研细的同一批(090901)样品粉末 2.0g 共 5) 份，按“2.3”项方法制备 5) 份样 品溶液，各吸取 10μll 进样，测定面积的 RSD 值为 0.99%(n=5))。表明方法重复性较好。 3.10 加样回收率实验 精密量取已知含量五味子样品液(五味子甲素浓度为 0.04136μlg/μll)5).0ml6 份，分别 精密加入浓度为 0.25)28mg/ml 的对照品溶液 0.25)、0.5)、1.0、1.5)、2.0、2.5)ml，并 分别用甲醇定溶至 10.0ml。分别进样 10μll，测定，并计算回收率。结果见表 1。表 1 加 样回收测定结果 3.11 样品含量测定结果 取 5) 批五味保肝丸(降酶丸)样品，批号分别是： 100312、100427、100604、100712、100802，按“2.3”步方法分别制备样品液，并 进样，测定，计算，5) 批样品五味子甲素含量分别为 0.3075)、0.3121、0.2976、0.2684、0.2713mg/g。按 5) 批样品含量测定结果，暂定 降酶丸中五味子甲素含量不低于 0.25)0mg/g。 4 讨论 五味保肝丸的主要药效成分为五味子，其主要有效成分为五味子甲素、五味子乙素。 《中国药典》以五味子甲素含量作为五味子药材质量的评价指标[1]，因此，以五味子甲素 含量作为该制剂的制备工艺和质量控制指标是可行的。 五味子甲素为脂溶性成分，能溶于乙醇、甲醇，极易溶于苯、氯仿、乙醚。因此，在 提取样品中一般都采用乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂超声提取后，挥干有机溶剂，残渣 加甲醇定容来制备样品溶液。本实验采用氯仿超声提取，甲醇定容来制备样品溶液，五味 子甲素加样回收率为 97.64%，RSD=1.41%(n=6)，效果满意。 HTLC 法测定五味子及其制剂中有效成分常用的流动相多用不同比例的甲醇-水[2～ 4]，也有用乙腈-水[5)，6]，乙腈-甲醇-水[7]和甲醇-四氢呋喃-水[8]。对比试验结果表明， 选用甲醇-水(80：20)，供试品溶液相邻峰分离度能满足实验要求。 摘要：清肺颗粒具有清热宣肺，化痰止咳的功能，用于治疗急性气管一支气管炎咳嗽。 本文在明确清肺胶囊成分的基础上，详细研究了清肺胶囊的药学提取工艺，并进一步探讨 了清肺胶囊的药学成型工艺以及药学质量测定。 关键词：清肺胶囊；药学提取工艺；药学成型工艺；药学研究 清肺颗粒来源于民间验方，处方根据风热袭肺型外感咳嗽患者的特点及其病因病机， 清热宣肺、化痰止咳以迅速缓解患者的咳痰症状，寒温兼施，升降并用，肺脾同调。组方 符合中医药理论及适应病症的病因病机。 1 清肺胶囊的成分 本品为复方制剂，主要的药物成分包括：黄岑提取物、连翘、浙贝母、百部、前胡、 苦杏仁、鱼腥草、甘草以及芦根。 其中，本方中黄琴苦寒，入心、肺、胆、大肠经。为方中君药。浙贝母苦寒，清热化 痰。研究表明，浙贝母的镇咳、祛痰和松弛气管平滑肌、抗炎和逆转细菌耐药等作用是其 治疗呼吸系疾病的作用机理。连翘苦凉。入心、肝、胆经。连翘挥发油对金黄色葡萄球菌、 肺炎双球菌、白色念珠菌有明显的抑制作用，连翘对结核杆菌也有抑制作用。 鱼腥草辛寒，清热解毒。鱼腥草具有广泛地抗菌、抗病毒作用，其抗菌、抗病毒等活 性物质是挥发油，主要成分为癸酞乙醛、月桂醛等。苦杏仁具有止咳平喘，润肠通便的作 用。百部甘苦，微温。入肺经。温润肺气，止咳。芦根甘，寒。归肺、胃经。用于肺热咳 嗽，肺痈吐脓。 前胡具有降气化痰，解痉、抗炎、抗过敏、抗溃疡，抗血小板凝集，抗心率失常等临 床作用。起到这些药理作用的主要是前胡内的各种类型的香豆素类化合物，此外还含有挥 发油、色原酮Ⅱ、黄酮Ⅱ、聚炔、木脂素、简单苯丙素衍生物等。甘草具有补脾益气、止咳祛 痰、清热解毒，缓急定痛、调和诸药等功效。 2 清肺胶囊的药学提取工艺 中药提取方法的恰当与否对中药制剂的疗效、稳定性等有较大影响。提取的目的是尽 量的提出有效成分或有效部位，最低限度的浸出无效或是有害物质，减少病患的服用量， 增加制剂的稳定性，提高疗效。 2.1 清肺胶囊的药学水提工艺 甘草、苦杏仁，芦根中止咳平喘祛痰主要化学成分是甘草酸，甘草次酸，它们均为三 菇类化合物，在植物中多以钾钙盐形式存在，可溶于水。苦杏仁普易溶于热水，天冬酞胺 溶于水，因此用水提。国内中药厂现有提取装置主要有超临界、超声、微波提取设备、罐 式提取设备、连续逆流提取机组。结合大生产实际，选择连续逆流提取机组进行处方水提 工艺的研究。连续逆流提取设备的工作原理是逆流提取液从低浓度级储液槽流向高浓度级 储液槽，从而利用浓度差使得提取更加快捷、完全。 取 9 份 0.1 倍处方量的甘草、苦杏仁、芦根及挥发油提取后的药渣装入五个提取罐中， 将提取罐中前一提取罐的提取液作为后一提取罐提取的母液，循环操作十三次。该提取过 程是一个动态连续的提取过程，收集各单元的提取液，合并滤过，调整体积，取样测定， 备用。 2.2 清肺胶囊的药学醇提工艺 结合大生产实际，本文选择连续逆流提取机组及回流提取对进行处方醇提工艺的研究。 其中，回流提取描述如下：取浙贝母、百部、前胡 0.1 倍处方量，置于圆底烧瓶中， 回流提取 2 次；第 1 次加 70%乙醇 8 倍量，回流 2.5)h；第 2 次加 70%乙醇 8 倍量，回流 2.5)h。滤过，调整体积至 2000mL，取样测定。 动态逆流提取法如下描述：取浙贝母、百部、前胡 0.1 倍处方量 9 份，平均装入五个 提取罐中；在提取罐中加入 70%乙醇进行提取，每次 10 倍量，每次 20min，循环提取 13 次。将提取罐中前一提取罐的提取液作为后一提取罐提取的母液。该提取过程是一个动 态连续的提取过程，我们收集 5) 个单元的提取液，合并滤过，调整溶液体积，取样测定， 备用。 2.3 清肺胶囊的药学挥发油提取工艺 处方中连翘、鱼腥草中的挥发油为药理活性成分之一，挥发油是植物体内的次生代谢 物，由相对分子质量较小的简单化合物组成，具有芳香气味，在常温下可挥发。在中药制 剂的研制和生产中，提取和保留挥发油成分是保障药物疗效的重要步骤之一。常用的挥发 油提取方法有水蒸气蒸馏法、压榨法、溶剂提取法、微波提取法、固相微提取法等。 考虑到工业生产的可行性，本文挑选水蒸气蒸馏法对处方中连翘，鱼腥草进行提取的 研究。按处方量称取鱼腥草、连翘药材一份，置挥发油提取器中，按照中国药典挥发油提 取法进行提取，油水分离后得鱼腥草、连翘挥发油。提取五小时之内挥发油量迅速上升， 五小时到七小时油量减缓增长，七小时以后油量变化不大。 3 清肺胶囊的药学成型工艺 3.1 挥发油的药学包合工艺 处方中连翘、鱼腥草中的挥发油为药理活性成分之一，而挥发油不稳定易挥发，在制 备成中成药中极易损失，若将挥发油直接药用，容易氧化变质，且容易挥散，研究用-环糊 精对连翘、鱼腥草挥发油进行包合的工艺以提高药材挥发油在制剂过程中的稳定性，保证 疗效。常用的挥发油包合工艺有饱和水溶液法、研磨法、冷冻干燥法。根据实际生产的要 求，在此选用饱和水溶液法进行研究。 3.2 浓缩、干燥的药学工艺考察 除杂工艺：试验结果表明，本品收膏率为 10.8%左右，每次服用量为 89 袋。为尽量 保留有效成分，本品对药液进行了浓缩、干燥工艺考察。按上述工艺操作后，浓缩至相对 密度为相对密度 1.15)-1.20(5)0℃测)，浸膏均分两份，加入糊精后，分别进行常压干燥和 减压干燥；结果减压干燥较疏松易粉碎。 3.3 辅料及用量的选择 随着人们生活水平的提高，进一步扩大患者的范围，尽量使用一些低糖或无糖产品。 糊精作为辅料，其溶解性较好，在生产、贮存、运输过程中，能有效防止吸潮、变质。制 剂在研制过程中，充分考虑到其口感，我们添加了适量的甜菊素作为矫味剂，以利于患者 的服用。我们取以上浸膏，分别加入 0.5) 倍，1 倍，1.5) 倍，2 倍于浸膏量的糊精，用 80%乙醇进行制粒，以成品率为指标进行考察。 此外，本文通过-CD 包合技术可以改变药物的理化性质，增加中药挥发性成分的稳定 性，提高药物的溶解度，降低药物的刺激性等，为中药新剂型的开发提供了有效的手段， 具有良好的发展前景。也采用饱和水溶液法进行包合，能较好地保存连翘和鱼腥草中挥发 性成分，操作简单，设备要求不高，对大生产有着积极意义。考察了成型辅料的用量及甜 菊素的用量，确定了清肺颗粒的成型工艺，保证了制剂工艺基本合理、可靠。 4 清肺胶囊的药学质量测定 由于药品的质量与病患的用药安全密切相关，必须制定药品的质量标准来控制药品的 质量，保证临床用药安全有效。质量标准的要求：对主要有效成分进行检识；检测专属性 强，快速，简便，重现性好；.制剂含量测定，应选择君药、贵重药、毒药制定含量测定方 法。本品为复方制剂，黄答是方中君药，黄琴普是黄琴中的有效成分之一，具有多种药理 作用，如降压、镇静、保肝、利胆、抗菌、消炎等，并针对方中药味和剂型特点，采用高