论口腔临床中牙周膜的再 生治疗

 【中图分类号】R722.12【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）10-0241-02 　　近年来，研究者发现，牙周膜细胞具有异质性，包含异质性细胞群，即由不同的亚型组成，细胞间存在差异，在表现型及功能上有所不同，其子代能增殖产生成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞。这些细胞亚型可处于不同的分化阶段或具有不定向的分化趋势，牙周组织再生修复与牙周膜细胞的异质性有密切关系。 
　　1材料和方法 
　　1.1主要试剂和仪器。DMEM培养液、FBS（Gibco公司，美国），胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、L-抗坏血酸、beta；-甘油磷酸钠（beta；-glycerophyosphate，beta；-GP）、消炎痛、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-xan-thine，IBMX）、胰岛素、beta；-巯基乙醇（beta；-mercap-toethanol，beta；-ME）（Sigma公司，美国），鼠抗人STRO-1多抗、鼠抗人CD146多抗（RDSystems公司，美国），CO2细胞培养孵箱（Heraeus公司，德国），超净工作台（苏州净化设备厂），低温高速离心机（Heraeus公司，德国），倒置显微镜及照像系统（Olympus公司，日本）。 
　　1.2组织块法细胞原代培养。收集临床上12～18岁因正畸需要拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，拔除后立即在双抗PBS液和DMEM液中反复清洗牙齿，刮下根中1/3牙周膜组织，剪成0.5mmtimes；0.5mmtimes；0.5mm左右的小块。 
　　1.3免疫细胞化学染色hPDLP的表面抗体。取生长良好的第1代细胞制备细胞爬片，用SABC法染色进行波形丝蛋白Vimentin、角蛋白Keratin、STRO-1、CD146免疫组化染色，阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤不变，进行细胞来源及表达检测，光镜观察。 
　　1.4流式细胞表型分析hPDLP的表面标记。取对数生长期的第1～3代细胞，0.25%胰酶消化1min，1000rmiddot；min-1离心5min，弃上清液，调整细胞密度为每毫升1times；106个，PBS洗2遍，加0.02mL的FCM缓冲液（含20gmiddot；L-1牛血清白蛋白和0.1gmiddot；L-1叠氮化钠）重悬，PE标记的STRO-1和FITC标记的CD146抗体避光4℃孵育20min，加0.2mLPBS重悬，流式细胞仪上机检测。 
　　2结果 
　　2.1细胞生长情况。组织块法原代培养的人牙周膜细胞3～6d后，可见多个组织块边缘有细胞开始游出，细胞形态无明显差别，大多数为长梭形成纤维状，1～2个突起；少数为多角形、纺锤状或椭圆形，体积较小，胞体丰满，生长较快，约7～14d开始汇合，以组织块为中心呈放射状、螺旋状生长原代hPDLP培养10d的生长状态倒置相差显微镜times；40。生长的细胞以1∶2传代培养，最初5代的细胞培养3～5d即可长满培养瓶瓶底，生长状态较活跃，核分裂象多见；6～12代细胞，培养7～10d铺满，细胞增殖稳定。 
　　2.2细胞表型鉴定。免疫组化显示细胞波形丝蛋白染色阳性第1代hPDLP抗波形丝蛋白的阳性染色SABCtimes；400，角蛋白染色阴性。第1代牙周膜细胞中部分细胞抗STRO-1和CD146染色着色，细胞表达STRO-1和CD146强弱不等第1代hPDLP抗CD146染色的阳性染色SABCtimes；400第1代hPDLP抗STRO-1的阳性染色SABCtimes；400。 
　　2.3流式细胞表型分析。流式细胞仪检测第1～3代的hPDLP，STRO-1阳性率分别为4.23%plusmn；4.08%、1.92%plusmn；1.77%和0.44%plusmn；0.24%，LSD法比较两两之间差异无统计学意义（P>0.05）；CD146阳性率分别为27.20%plusmn；3.98%、18.83%plusmn；4.04%和10.61%plusmn；4.61%，LSD法比较两两之间差异均有统计学意义（P